Принципи на лазерната конфокална микроскопия (LSCM)
Лазерният конфокален микроскоп използва отвор за осветяване, поставен зад източника на светлина, и отвор за откриване, поставен пред детектора, за да се постигне точково осветяване и точково откриване. Светлината от светлинния източник се фокусира върху точка във фокалната равнина на пробата от светлина, излъчена през осветителния отвор, а флуоресценцията, излъчена от тази точка, се изобразява в отвора за откриване и всяка излъчена светлина извън тази точка се блокира от дупка за откриване. Точковият отвор за осветяване и откриващият отвор са свързани за осветената или засечена точка, така че засечената точка е конфокалната точка, а равнината, в която е разположена засечената точка, е конфокалната равнина. Компютърът показва откритата точка на екрана на компютъра под формата на изображение на точка. За да се получи цялостно изображение, сканираща система в оптичния път сканира върху фокалната равнина на пробата, като по този начин създава пълно конфокално изображение. Докато носещият етап се движи нагоре и надолу по Z-осата, ново ниво на пробата се премества към конфокалната равнина и новото ниво на пробата се изобразява на монитора, докато Z-оста продължава да движение, се получават последователни светлинни изображения на различни нива на пробата.
Традиционният оптичен микроскоп използва полеви източник на светлина, изображението на всяка точка върху образеца ще бъде повлияно от дифракцията или разсейването на светлината от съседните точки; лазерно сканиращият конфокален микроскоп използва лазерен лъч през осветената дупка, за да образува точков източник на светлина върху образеца, сканиран във всяка точка от вътрешната фокална равнина, образецът върху облъчената точка, изображението на отвора за откриване, чрез откриване на отвор след точковата умножителна тръба (PMT) или студено електросъединено устройство (cCCD) Получено точка по точка или линия по линия, флуоресцентно изображение бързо се формира на екрана на компютърния монитор. Осветителната дупка и дупката за откриване спрямо фокалната равнина на лещата на обектива са спрегнати, точката на фокалната равнина в същото време е фокусирана върху дупката за осветяване и емисионната дупка, точката извън фокалната равнина няма да бъде в откриването на дупка при изображението, така че полученото конфокално изображение да е оптичното напречно сечение на образеца, преодолявайки недостатъците на размитото изображение на обикновен микроскоп.
От основния принцип лазерният конфокален микроскоп е модерен оптичен микроскоп, това е обикновеният светлинен микроскоп от технологията, за да направи следните подобрения.
1. Използвайте лазер като източник на светлина, тъй като монохроматичността на лазера е много добра, дължината на вълната на лъча на светлинния източник е същата, като основно елиминира хроматичната аберация.
2. Използването на конфокална технология във фокалната равнина на лещата на обектива, поставена в средата с малък отвор в преградата, фокалната равнина извън разсеяната светлина блокира, елиминирайки сферичната аберация; и допълнително премахване на хроматичната аберация.
3. Лазерен конфокален микроскоп, използващ технология за точково сканиране за разлагане на пробата в двуизмерно или триизмерно пространство в безброй точки, с много малък лазерен лъч (точков светлинен източник) точка по точка, линия по линия сканиращо изображение и след това през микрокомпютърната комбинация от цяла равнина или триизмерно изображение. Традиционният светлинен микроскоп е полеви източник на светлина под еднократното изображение, образците на всяка точка от изображението ще бъдат в съседство с точката на дифрактирана светлина и интерференция на разсеяна светлина. Яснотата и прецизността на тези две изображения не могат да се сравняват.
4. Получаване и обработка на оптични сигнали с компютър и усилване на сигналите с фотоумножител
В лазерния конфокален микроскоп компютърът замества човешкото око или камерата за наблюдение и видеозапис, а получените изображения се дигитализират и могат да бъдат обработени в компютъра, за да се подобри отново яснотата на изображенията. Освен това използването на фотоумножителни тръби може да усили много слаби сигнали, което значително подобрява чувствителността. В резултат на комбинираното използване на горните технологии, може да се каже, че LSCM е най-модерният микроскоп в света. Може да се каже, че LSCM е комбинация от технология за производство на микроскоп, фотоелектрическа технология, компютърна технология **, е неизбежният продукт на развитието на съвременните технологии.
