Познания за дву-фотонната флуоресцентна микроскопия
Основният принцип на дву-фотонното възбуждане е, че при висока фотонна плътност флуоресцентните молекули могат едновременно да абсорбират два фотона с дълга дължина на вълната и да излъчват фотон с по-къса дължина на вълната след кратък период на така-нареченото време на живот във възбудено състояние; Ефектът е същият като използването на фотон с половината от дължината на вълната на дългата дължина на вълната за възбуждане на флуоресцентни молекули. Двуфотонното възбуждане изисква висока фотонна плътност и за да се избегне увреждане на клетките, дву-фотонната микроскопия използва високо-енергиен режим-заключени импулсни лазери. Лазерът, излъчван от този лазер, има висока пикова енергия и ниска средна енергия, с ширина на импулса от само 100 фемтосекунди и честота до 80 до 100 мегахерца. Когато се използва леща на обектив с висока цифрова апертура за фокусиране на фотоните на импулсен лазер, плътността на фотоните във фокусната точка на лещата на обектива е най-висока и дву-фотонното възбуждане възниква само във фокусната точка на лещата на обектива. Следователно, дву-фотонният микроскоп не изисква конфокална дупка, което подобрява ефективността на флуоресцентното откриване.
При общите явления на флуоресценция, поради ниската фотонна плътност на възбуждащата светлина, флуоресцентната молекула може да абсорбира само един фотон наведнъж и след това да излъчва друг флуоресцентен фотон чрез радиационен преход, който е известен като единична фотонна флуоресценция. При процеси на възбуждане на флуоресценция, използващи лазери като източници на светлина, могат да се появят дву-фотонни или дори многофотонни флуоресцентни явления. В този случай използваният източник на възбуждаща светлина има висок интензитет и плътност на фотоните, които отговарят на изискването флуоресцентните молекули да абсорбират два фотона едновременно. В процеса на използване на общ лазер като източник на възбуждаща светлина, плътността на фотоните все още е недостатъчна, за да произведе феномен на дву-фотонна абсорбция. Обикновено се използват фемтосекундни импулсни лазери с моментна мощност, достигаща мегаватово ниво. Следователно дължината на вълната на дву-фотонната флуоресценция е по-къса от тази на възбуждащата светлина, еквивалентна на ефекта, получен от възбуждане с дължина на вълната на половин възбуждане.
