Има два вида флуоресцентни микроскопи по отношение на техния оптичен път
1. Трансмисионен флуоресцентен микроскоп: Източникът на възбуждаща светлина преминава през материала на пробата през кондензаторна леща, за да възбуди флуоресценцията. Обикновено се използва колектор за тъмно поле, а обикновен колектор може да се използва и за регулиране на огледалото, така че възбуждащата светлина да се пренасочва и заобикаля към образеца. Това е по-стар флуоресцентен микроскоп. Предимството е, че флуоресценцията е силна при ниско увеличение, но недостатъкът е, че флуоресценцията намалява с увеличаването на увеличението. Поради това е по-добре да се наблюдават по-големи материали за проби.
2. Епи-флуоресцентният микроскоп е нов тип флуоресцентен микроскоп, разработен в съвремието. Разликата е, че възбуждащата светлина пада от лещата на обектива надолу към повърхността на образеца, т.е. същата леща на обектива се използва като кондензатор за осветяване и леща на обектива за събиране на флуоресценция. Дихроичен разделител на лъча трябва да се добави в светлинния път, който е на 45 градуса от лекия уран. Възбуждащата светлина се отразява в лещата на обектива и се събира върху пробата. Флуоресценцията, генерирана от пробата, и възбуждащата светлина, отразена от повърхността на лещата на лещата на обектива и повърхността на покриващото стъкло, влизат в лещата на обектива едновременно и се връщат към двуцветния разделител на лъча, за да направят възбуждащата светлина отделена от флуоресценцията , остатъчната възбуждаща светлина се абсорбира от блокиращи филтри. Като промяна на комбинация от различни възбуждащи филтри/двуцветен разделител на лъчи/блокиращ филтър, той може да отговори на нуждите на различни флуоресцентни реакционни продукти. Предимството на този вид флуоресцентен микроскоп е, че осветяването на зрителното поле е равномерно, изображението е ясно и колкото по-голямо е увеличението, толкова по-силна е флуоресценцията.
