Основният метод за наблюдение на оптичния микроскоп е флуоресцентното наблюдение
Флуоресценцията се отнася до процеса, при който флуоресцентно вещество излъчва светлина с по-голяма дължина на вълната почти едновременно, когато се облъчва със светлина с определена дължина на вълната (Фигура 1). Когато светлина с определена дължина на вълната (дължина на вълната на възбуждане) удари молекула, като тези във флуорофора, фотонната енергия се абсорбира от електроните на молекулата. След това електроните преминават от основно състояние (S0) към по-високо енергийно ниво, възбуденото състояние (S1'). Този процес се нарича възбуждане①. Електронът остава във възбудено състояние за 10-9–10-8 секунди, по време на които електронът губи част от енергия②. По време на процеса на напускане на електрони от възбудено състояние (S1) и връщане в основно състояние③, останалата енергия, погълната по време на процеса на възбуждане, се освобождава.
Времето на престой на флуоресцентната молекула във възбудено състояние е продължителността на живота на флуоресценцията, която обикновено е на ниво наносекунди и е присъща характеристика на самата флуоресцентна молекула. Доживотно флуоресцентно изображение (FLIM), което използва технология за флуоресцентно доживотно изобразяване, се нарича доживотно флуоресцентно изображение (FLIM). В допълнение към изобразяването на интензитета на флуоресценцията, могат да се получат по-задълбочени функционални и точни измервания, за да се получи молекулна конформация, междумолекулни взаимодействия и микросредата на молекулите. Информация, която е трудно да се получи с конвенционалните оптични изображения.
Друго важно свойство на флуоресценцията е отместването на Стокс, разликата в дължината на вълната между пиковете на възбуждане и излъчване (Фигура 2). Обикновено дължината на вълната на излъчване е по-дълга от дължината на вълната на възбуждане. Това е така, защото електроните ще загубят част от енергията си чрез процеса на релаксация, след като флуоресцентното вещество е възбудено и преди да освободят фотони. Флуоресцентните вещества с по-големи Стоксови измествания се наблюдават по-лесно под флуоресцентен микроскоп.
Флуоресцентна микроскопия и флуоресцентни филтърни кубове
Флуоресцентният микроскоп е оптичен микроскоп, който използва флуоресцентни свойства за наблюдение и изобразяване и се използва широко в различни области като клетъчна биология, невробиология, ботаника, микробиология, патология и генетика. Флуоресцентното изобразяване има предимствата на висока чувствителност и висока специфичност и е много подходящо за наблюдение на разпределението на специфични протеини и органели в тъкани и клетки, изследване на колокализация и взаимодействие, проследяване на динамични процеси в живота, като промени в концентрацията на йони и т.н.
Повечето молекули в клетките не флуоресцират и за да ги видите, те трябва да бъдат флуоресцентно маркирани. Има много методи за флуоресцентно маркиране, като директно маркиране (като използване на DAPI за маркиране на ДНК) или имунооцветяване с помощта на антиген-свързващите свойства на антителата, или използване на флуоресцентни протеини (като GFP, зелен флуоресцентен протеин) за маркиране на целеви протеини , и обратимо свързване. Синтетични багрила (като Fura-2) и т.н.
Понастоящем флуоресцентният микроскоп се е превърнал в стандартно оборудване за изображения на различни лаборатории и платформи за изображения и е добър помощник за нашите ежедневни експерименти. Флуоресцентните микроскопи се разделят основно на три категории: изправени флуоресцентни микроскопи (подходящи за нарязване), обърнати флуоресцентни микроскопи (подходящи за живи клетки, като се има предвид нарязването), флуоресцентни стереоскопи (подходящи за по-големи екземпляри, като растения, риба зебра (възрастни/ембриони) ), медака, органи на мишка/плъх и др.).
Флуоресцентният филтърен блок е основният компонент на микроскопското флуоресцентно изображение. Състои се от три части: възбуждащ филтър, емисионен филтър и дихроичен светоразделител. Монтира се във филтърното колело. Например Leica DMi8 е оборудван с 6-позиционно филтърно колело (фиг. 3). Броят на позициите на различните колела на микроскопа ще бъде различен и някои микроскопи използват слайдове с филтърни блокове.
Филтърният блок играе важна роля във флуоресцентното изобразяване: филтърът за възбуждане избира светлината за възбуждане, за да възбуди пробата, и блокира светлината с други дължини на вълната; светлината, преминаваща през възбуждащия филтър, преминава през дихроичното огледало (неговата функция е да отразява възбуждащата светлина и да предава флуоресценцията), след отражението тя се фокусира от лещата на обектива, облъчва пробата и възбужда съответната флуоресценция, т.е. , излъчвана светлина. Излъчената светлина се събира от лещата на обектива, преминава през дихроичния разделител на лъча и достига до емисионния филтър. Както е показано на Фигура 4: дължината на вълната на възбуждане е 450-490nm, дихроичното огледало отразява светлина, по-къса от 510nm, пропуска светлина, по-дълга от 510nm, и обхватът на приемане на излъчваната светлина е 520-560nm.
