Разликата между положителен и отрицателен фазов контраст в микроскоп
В зависимост от конфигурацията и естеството на фазовия пръстен, разположен в задната фокална равнина на обектива, пробите могат да се наблюдават в положителен или отрицателен фазов контраст. Този интерактивен урок изучава връзката между съраунд (S), дифракция (D) и произтичащи ярки частици (P вълни), както и микроскопия с положителен и отрицателен фазов контраст. В допълнение, геометрията на фазовата плоча и представителни примерни изображения също са представени.
Когато хората го използват в работата си сега, повечето от изследователите са в отрицателната разлика, а сега положителната разлика не играе голяма роля в текущата научноизследователска работа.
Урокът инициализира фазовото изображение с произволно избрана проба, която се появява в прозореца Phase Contrast Image, и съответната връзка на вълната се показва в левия съсед на прозореца на изображението. За да работите с урока, използвайте курсора на мишката, за да преместите транслацията между положителния и отрицателния фазов контраст или плъзгача за режим на фазов контраст на ярко осветление. Когато плъзгачът се премести, изображенията, които се появяват в прозореца на изображението с фазов контраст, променят начина, по който образецът изглежда в текущия режим на изображение, зададен от плъзгача. Освен това под графиката на формата на вълната има фазова плоча, която променя формата си, за да съответства на режима на изображение, избран от плъзгача. За да видите нова проба, използвайте падащото меню Избрана проба, за да изберете друга проба.
График на конфигурацията на фазовата плоча, връзките на вълните и векторите, свързани с генерирането на изображения с положителен и отрицателен фазов контраст, е представен на Фигура 1. Показани са също примери за образци, изобразени с тези техники. В оптична конфигурация с положителен фазов контраст (горен ред на изображението на фигура 1), съраунд (S)-фронтът на вълната преминава през фазовата плоча, което води до нетно фазово изместване от 180 градуса напредване на фазата с 1/4 дължина на вълната ( 1 половин дължина на вълната). Усъвършенстваните съраунд вълнови фронтове вече могат да участват в разрушителна интерференция с дифрактирани (D) вълни в междинната равнина на изображението. В повечето случаи простото придвижване напред на относителната фаза на заобикалящия вълнов фронт не е достатъчно, за да доведе до генериране на изображения с висок контраст в микроскопите на Nikon. Това е така, защото амплитудата на съраунд вълните е значително по-голяма от тази на дифрактираните вълни и потиска полученото изображение, създадено от смущения от част от общия брой вълни. За да се намали околният фронт на вълната до стойност, по-близка до амплитудата на дифрактираните вълни (и да се извърши интерференция в равнината на изображението), непрозрачността във фазовия пръстен на обектива се получава чрез прилагане на полупрозрачен метал (неутрална нарастваща плътност ) покритие Под. Околните светлинни вълни, които преминават почти изцяло през фазовия пръстен по дизайн, при фазово контрастна микроскопия, са значително намалени по амплитуда от непрозрачността на фазовата плоча до стойност в диапазона от 10 до 30 процента от първоначалния интензитет.
Тъй като получената вълна от частици се произвежда от интерференцията* на околните и дифрактирани вълнови фронтове, амплитудата на частицата (P) вълна, произведена от интерференцията между вълновите фронтове, пристигащи в равнината на изображението, сега е много по-малка от околната, когато е в Сексуално нанесено плътно покритие. Крайният ефект е да преобразува относителната фазова разлика, въведена от преминаването на светлината, излизаща от равнината на изображението през образеца, в разлика в амплитудата (интензитета). Тъй като човешкото око ще интерпретира разликата в интензитета като контраст, образецът вече се вижда в окуляра на микроскопа и може също да бъде уловен върху мембраната с конвенционални камерни системи или цифрово, използвайки CCD или CMOS устройства. Всички системи с положителен фазов контраст избирателно изпреварват фазата на линейния съраунд (S) фронт на вълната спрямо сферичния дифрагиран (D) фронт на вълната. Образците с по-висок индекс на пречупване от околната среда изглеждат по-тъмни на неутрален сив фон, докато тези с по-нисък индекс на пречупване от плувната среда изглеждат по-ярки от сивия фон.
За да се модифицира пространственото разделяне на дифрагираните вълнови фронтове, заобикалящи фазата и амплитудата във фазова контрастна оптична система, бяха въведени редица конфигурации на фазова плоча. Тъй като фазовата плоча е разположена на или много близо до задната фокална равнина на обектива (дифракционна равнина), цялата светлина, която преминава през микроскопа, трябва да преминава през този компонент. Частта от фазовата плоча в нейния пръстеновиден фокус на кондензатора се нарича конюгирана област, докато останалата област се нарича комплементарна област. Конюгираният регион съдържа материала, отговорен за промяната на фазата на заобикалящата (недифрактирана) светлина с плюс или минус 90 градуса по отношение на дифрактирания вълнов фронт. Като цяло площта на фазово спрегнатия пръстен е по-широка (около 25 процента) от зоната, определена от изображението на кондензиращия пръстен, за да се намали количеството заобикаляща светлина, която се разпространява към допълнителната област.
Повечето фазови плочи, предлагани от съвременните производители на микроскопи, са едни от тези, приготвени чрез вакуумно отлагане на тънки диелектрични и метални филми върху стъклена плоча или монтирани директно върху повърхността на лещата на обектива на микроскопа. Ролята на диелектричния филм е да фазира светлината, докато металният филм намалява интензитета на недифрактираната светлина. Някои производители използват множество антирефлексни покрития, комбинирани с филма, за да намалят количеството отблясъци и отражението на разсеяната светлина обратно в оптичната система. Ако фазовата плоча не е оформена върху повърхността на леща, тя обикновено се циментира между последователни лещи, които се намират във фокалната равнина близо до задната част на обектива. Дебелината и индексът на пречупване на диелектричните, металните и антирефлексните покрития, както и тези на оптичния цимент, са внимателно избрани, за да се получи желаното фазово изместване между комплементарните и спрегнатите области на фазовата плоча. От оптична гледна точка фазова плоча, която променя фазата спрямо заобикалящата светлина, за да дифрактира светлината на 90 градуса (положително или отрицателно), се нарича четвърт вълнова плоча поради ефекта на разликата в оптичния път върху нея.
Общ преглед на обратното на положителната фаза е показано на Фигура 1. Контрастната плоча на положителната фаза (лявата страна на Фигура 1) задвижва съраунд вълната с 1/4 дължина на вълната поради ерозионния пръстен в стъклената плоча, който може бъде намалена от горния проход в плочата с висок индекс Физическият път на вълната, който е извървян. Поради взаимодействието с пробата, когато дифрактираните лъчи на пробата (D) са забавени, оптичната разлика в пътя между обкръжаващите и дифрагираните вълни, които излизат от фазовата плоча, е половината от дължината на вълната на 1/4 дължина на вълната. Крайният резултат е 180-градусова разлика в оптичния път между околните и дифрактирани вълни, което води до разрушителна интерференция за проби с висок индекс на пречупване между равнините на изображението. Амплитудната крива за положителната фаза срещу разрушителната интерферентна вълна е показана в горната графика на Фигура 1. Получената частица (P) вълна има по-ниска амплитуда от съраунд (S) вълната, като по този начин обектът изглежда в сравнение с относително по-тъмен фон. Долу, изображение на зелени водорасли Zygnema, показано вдясно (обозначено с DL). Векторът, представен от прогреса на 1/4 дължина на вълната, който е показан като 90-градус въртяща се съраунд вълна обратно на часовниковата стрелка в положителен фазов контраст, се появява между фигурата и изображението на Фигура 1.
Като алтернатива, оптиката на микроскопа може също да бъде произведена, за да произведе противоположна отрицателна фаза, както е показано в долната част на Фигура 1, в който случай съраунд (S)-вълните се забавят (вместо като напредват) с една четвърт дължина на вълната спрямо едната дифрактирана (D) вълна. В резултат на това образците с висок индекс на пречупване изглеждат по-ярки на по-тъмен сив фон (вижте долното изображение, обозначено като BM на фигура 1). В противоположната отрицателна фаза обективната фазова плоча съдържа повдигнат пръстен, който забавя фазата (вместо да напредва фазата като противоположната положителна фаза), преминавайки една четвърт дължина на вълната спрямо фазата на дифрагираната вълна като съраунд вълна от нулев порядък. Тъй като дифрактираните вълни са били забавени с една четвърт дължина на вълната, докато преминават през образеца, оптичната разлика в пътя между заобикалящите и дифрактираните вълни се елиминира и пробата с висок индекс на пречупване се намесва конструктивно в равнината на изображението. Обърнете внимание, че получената частица (P) вълна е с по-висока амплитуда от съраунд вълната (S) при отрицателен фазов контраст. Също така е показано отрицателно обръщане на фазата, където околосветският вълнов вектор преминава през въртене на 90 градуса по часовниковата стрелка на векторната диаграма.
