Стандартна процедура за калибриране на поляризатори в поляризационен микроскоп
Флуоресцентният микроскоп е различен от обикновения оптичен микроскоп по това, че не наблюдава образци при осветяване на обикновени светлинни източници. Вместо това той използва определена дължина на вълната на светлината (обикновено ултравиолетова светлина, синьо-виолетова светлина), за да възбуди флуоресцентните вещества вътре в образеца под микроскопа, карайки ги да излъчват флуоресценция. Следователно ролята на източника на светлина във флуоресцентния микроскоп не е директно осветяване, а като източник на енергия за възбуждане на флуоресцентните вещества вътре в образеца. Причината, поради която можем да наблюдаваме образци, не се дължи на осветяването на източника на светлина, а на феномена на флуоресценция, проявяван от флуоресцентните вещества вътре в образеца след абсорбиране на възбудената светлинна енергия. От това може да се види, че характеристиката на флуоресцентната микроскопия е главно, че нейният източник на светлина може да достави голямо количество възбуждаща светлина в определен диапазон на дължина на вълната, така че флуоресцентните вещества в образеца да могат да получат необходимия интензитет на възбуждаща светлина. В същото време флуоресцентните микроскопи трябва да имат съответните филтърни системи. Флуоресцентният микроскоп е основен инструмент във флуоресцентната тъканна химия. Състои се от основни компоненти като свръх-източник на светлина с високо напрежение, филтърна система (включително филтърни плочи за възбуждане и потискане), оптична система и фотографска система. Той използва светлина с определена дължина на вълната, за да възбуди образеца и да излъчва флуоресценция.
1. Методи за възбуждане на флуоресценция: Според обхвата на дължината на вълната на светлината има два вида: метод на UV възбуждане (използване на ултравиолетово осветление) и метод на възбуждане на BV (използване на синя виолетова светлина). Методът на UV възбуждане използва близка ултравиолетова светлина, по-къса от 400 nm за възбуждане. Този метод няма видима възбуждаща светлина, така че наблюдаваната флуоресценция показва присъщата флуоресценция на багрилото, което улеснява разграничаването на специфичната флуоресценция върху образеца от собствената флуоресценция на фоновата тъкан.
2. BV метод на възбуждане: включва възбуждане от ултравиолетова до синя светлина, центрирана при 404nm и 434nm. Този метод използва синя светлина за облъчване на образеца, така че прекъсващият-филтър на системата за наблюдение на флуоресценцията трябва да използва филтър, който може напълно да блокира синята светлина и да премине напълно през необходимата зелена и жълта флуоресценция. Флуоресцентни пигменти, използвани за метода на флуоресцентни антитела. Максималната дължина на вълната на поглъщане на възбуждащата светлина и максималната дължина на вълната на излъчване на флуоресценцията са относително близки, така че филтърът, използван при метода на възбуждане на BV, трябва да използва филтър с рязко отрязване. Този метод може да използва синя светлина като възбуждаща светлина, така че ефективността на абсорбция на флуоресцентните пигменти е висока и могат да се получат по-ярки изображения. Недостатъкът е, че флуоресценцията под 500 nm не може да се види, докато флуоресценцията над 500 nm кара цялото изображение да изглежда жълто. При метода на флуоресцентните антитела специфичността се определя най-вече от цвета, уникален за флуоресцентните пигменти, така че когато се обсъжда фината специфичност, споменатите по-горе недостатъци на метода за възбуждане на BV често оказват значително влияние.
