Техники на оцветяване и микроскопско наблюдение на микроорганизми
Просто оцветяване на бактерии
1 Цели
1.1 Да се научат основните техники за микробно намазване и оцветяване.
1.2 Да овладеят простия метод на оцветяване на бактериите.
1.3 Да се запознаят с морфологичните характеристики на бактериите и да консолидират обучението за използването на маслено огледало и техники за асептична работа.
2 Принцип Намазката и оцветяването на бактерии е основна техника в микробиологичните експерименти. Клетките на бактериите са малки и прозрачни, не се разпознават лесно под обикновен светлинен микроскоп и трябва да се оцветят. Използването на едно багрило за оцветяване на бактериите, така че оцветеният организъм и фонът да образуват ясна цветова разлика, така че тяхната морфология и структура да могат да се наблюдават по-ясно. Този метод е лесен за изпълнение и е подходящ за наблюдение на общата форма на организма и разположението на бактериите. Алкалните багрила обикновено се използват за просто оцветяване, тъй като в неутрални, алкални или слабо киселинни разтвори бактериалните клетки обикновено са отрицателно заредени, а когато алкалните багрила се йонизират, оцветяващата част от техните молекули е положително заредена, така че оцветяващата част на алкалните багрила може лесно да се свърже с бактериите, за да направи бактериите оцветени. Оцветените бактериални клетки контрастират рязко с фона и се разпознават по-лесно под микроскоп. Често използваните багрила за просто оцветяване включват мероцианиново синьо, кристално виолетово и основно съединение червено. Когато бактериалното разлагане на захарта до получаване на киселина, така че рН на средата намалява, положителният заряд на бактериите се увеличава и след това може да се използва в червено, киселинно червено или конго червено и други киселинни багрила. Бактериите трябва да бъдат фиксирани преди оцветяване. Целта му е двойна: едната е да убие бактериите и да ги накара да се придържат към предметното стъкло; второто е да увеличи афинитета си към багрилото. Обикновено се използват два метода: нагряване и химическа фиксация. Опитайте се да запазите оригиналната морфология на клетките при фиксиране.
3 Материали
3.1 Щам Bacillus subtilis 12-18h хранителна агар наклонена култура, Staphylococcus aureus около 24 h хранителна агар наклонена култура, Escherichia coli 24 h хранителна агар наклонена култура, хлебна мая агар наклонена култура.
3.2 Оцветяване Алкално метиленово синьо оцветяване на Lue (или кристално виолетово оцветяване с амониев оксалат), червено оцветяване от съединение на карболова киселина.
3.3 Инструменти или други принадлежности Микроскоп, спиртна лампа, предметно стъкло, инокулационен пръстен, държач за предметно стъкло, двуслойна бутилка (пълна с кедрово масло и ксилен), хартия за микроскоп, физиологичен разтвор или дестилирана вода и др.
4 Процедура Намазка → изсушаване → фиксиране → оцветяване → измиване → изсушаване → микроскопско изследване.
5 стъпки
5.1 цитонамазка Вземете две чисти и обезмаслени слайдове, всяко с малка капка физиологичен разтвор (или дестилирана вода) в центъра на предметното стъкло при асептични условия, с инокулиращ пръстен за асептична работа съответно от Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus и Escherichia coli наклонете, за да вземете малко мъх в капката вода, смесете и покрийте с филм. Ако бактериалната суспензия (или течна култура) се намазва, може да се използва за инокулиране на 2 до 3 пръстена директно върху предметното стъкло. Обърнете внимание, че физиологичният разтвор (дестилирана вода) и вземете бактериите не трябва да са твърде много и да се разпространяват равномерно, не твърде дебели.
5.2 Сушене Сушете естествено на стайна температура. Може да се изсуши и чрез леко нагряване над спиртна лампа с покритата страна нагоре. Въпреки това, не се доближавайте твърде много до пламъка, защото твърде високата температура ще унищожи морфологията на бактериите.
5.3 Фиксиране Ако се използва топлинно сушене, фиксацията и сушенето се комбинират в една стъпка по същия начин като сушенето. Намажете, подсушете и топлинно фиксирайте.
5.4 Оцветяване Поставете предметното стъкло плоско върху рафта за предметни стъкла, добавете 1 до 2 капки оцветяващ разтвор върху натривката (разтворът за оцветяване само покрива филма на натривката е подходящ). Оцветете цитонамазката с Lü's Basic Mellanox Blue за 1~2 минути и с карбонатно червено (или амониев оксалат кристално виолетово) за около 1 минута.
5.5 Изплакване Излейте оцветяващия разтвор и внимателно изплакнете с чешмяна вода от единия край на предметното стъкло, докато водата, която се стича от петното, стане безцветна. Когато изплаквате, не оставяйте водата да тече директно, за да измие покритата повърхност. Потокът на водата не трябва да бъде твърде бърз или твърде силен, за да се избегне разместването на филма на петна.
5.6 Изсушаване Разклатете водните капчици върху предметното стъкло, за да изсъхне естествено, изсушете със сешоар или може да използвате абсорбираща хартия, за да абсорбирате сухото (внимавайте да не избършете бактериалното тяло). 5.7 Микроскопско изследване Намазката се изсушава и се изследва под микроскоп. Намазката трябва да е напълно суха, преди да може да се наблюдава с маслен микроскоп.
6 Резултати Начертайте морфологията на E. coli и Micrococcus garciniae след единично оцветяване.
Оцветяване по Грам
1 Цел
1.1 Да разбере принципа на оцветяването по Грам и значението му при класифицирането и идентифицирането на бактерии.
1.2 Да научите и овладеете техниката на оцветяване по Грам и да затвърдите обучението за използването на маслената леща на светлинния микроскоп.
