Принцип и приложение на флуоресцентната микроскопия
(1) Принципът и структурните характеристики на флуоресцентния микроскоп: флуоресцентният микроскоп използва точков източник на светлина с висока светлинна ефективност, за да излъчва светлина с определена дължина на вълната (като ултравиолетова светлина 3650 in или лилаво синя светлина 4200 in) през филтърна система като възбуждаща светлина за възбуждане на образеца. След като флуоресцентното вещество вътре излъчва флуоресценция в различни цветове, то се наблюдава чрез увеличение на лещата на обектива и окуляра. По този начин, при силен контрастен фон, дори ако флуоресценцията е много слаба, той е лесен за идентифициране и има висока чувствителност. Използва се главно за изследване на клетъчна структура и функция и химичен състав. Основната структура на флуоресцентния микроскоп се състои от обикновен оптичен микроскоп плюс някои аксесоари (като източник на флуоресцентна светлина, възбуждащ филтър, двуцветен разделител на лъча и блокиращ филтър и др.). Флуоресцентен източник на светлина - обикновено използвайте живачна лампа с ултрависоко налягане (50-200W), която може да излъчва светлина с различни дължини на вълната, но всяко флуоресцентно вещество има дължина на вълната на възбуждане, която произвежда най-силната флуоресценция, така че е необходимо да добавите възбуждащ филтър (като цяло има ултравиолетови, лилави, сини и зелени възбуждащи филтри), които позволяват само на възбуждаща светлина с определена дължина на вълната да преминава през и да облъчва образеца, докато абсорбира друга светлина. След като всяко вещество бъде облъчено от възбуждаща светлина, то излъчва видима флуоресценция с по-голяма дължина на вълната от дължината на вълната на облъчване за много кратко време. Флуоресценцията е специфична и обикновено по-слаба от възбуждащата светлина. За да се наблюдава специфична флуоресценция, е необходим блокиращ (или потискащ) филтър зад лещата на обектива. Той има две функции: едната е да абсорбира и блокира навлизането на възбуждащата светлина в окуляра, за да не наруши флуоресценцията и да не повреди очите; другият е да изберете и оставите специфичната флуоресценция да премине, показвайки специфичен флуоресцентен цвят. Двата филтъра трябва да се използват заедно.
Има два вида флуоресцентни микроскопи по отношение на техните оптични пътища:
1. Трансмисионен флуоресцентен микроскоп: Източникът на възбуждаща светлина възбужда флуоресценция през материала на пробата през кондензаторната леща. Обикновено се използва колектор за тъмно поле, а обикновен колектор може да се използва и за регулиране на огледалото, така че възбуждащата светлина да се предава и заобикаля към образеца. Това е старомоден флуоресцентен микроскоп. Предимството е, че флуоресценцията е силна при ниско увеличение, а недостатъкът е, че флуоресценцията намалява с увеличаването на увеличението. Поради това е по-добре да се наблюдават материали с по-големи проби.
2. Епи-флуоресцентен микроскоп Това е нов тип флуоресцентен микроскоп, разработен в съвремието. Разликата е, че възбуждащата светлина пада от лещата на обектива към повърхността на образеца, т.е. същата леща на обектива се използва като кондензатор за осветяване и леща на обектива за събиране на флуоресценция. Дихроичен разделител на лъча трябва да се добави в светлинния път, който е на 45 градуса от лекия уран. Възбуждащата светлина се отразява в лещата на обектива и се събира върху пробата. Флуоресценцията, генерирана от пробата, и възбуждащата светлина, отразена от повърхността на лещата на лещата на обектива и повърхността на покриващото стъкло, влизат в лещата на обектива едновременно и се връщат към двуцветния разделител на лъча, за да направят възбуждащата светлина отделена от флуоресценцията , остатъчната възбуждаща светлина се абсорбира от блокиращи филтри. Ако преминете към комбинация от различни филтри за възбуждане/двуцветни разделители на лъчи/блокиращи филтри, нуждите от различни флуоресцентни реакционни продукти могат да бъдат задоволени. Предимството на този вид флуоресцентен микроскоп е, че осветяването на зрителното поле е равномерно, изображението е ясно и колкото по-голямо е увеличението, толкова по-силна е флуоресценцията.
(2) Как да използвате флуоресцентния микроскоп.
1. Включете източника на светлина, живачната лампа със свръхвисоко налягане трябва да се загрее за няколко минути, за да достигне най-ярката точка.
2. За трансмисионния флуоресцентен микроскоп необходимият филтър за възбуждане трябва да бъде монтиран между източника на светлина и кондензатора, а съответният блокиращ филтър трябва да бъде монтиран зад лещата на обектива. Епифлуоресцентните микроскопи трябва да вмъкнат необходимия филтър за възбуждане/двоен цветен разделител на лъча/вложки за блокиращ филтър в слотовете на пътя на светлината.
3. Наблюдавайте с обектив с ниско увеличение и регулирайте центъра на светлинния източник според устройството за регулиране на различните видове флуоресцентни микроскопи, така че да се намира в центъра на цялото светлинно петно.
4. Поставете листа с образеца и наблюдавайте след фокусиране. Трябва да се обърне внимание по време на употреба: Не наблюдавайте директно с крайния филтър, за да не причините увреждане на очите; при наблюдение на препарата с маслена леща трябва да се използва специална маслена леща без флуоресценция; след като живачната лампа с високо налягане е изключена, тя не може да се включи отново веднага и трябва да се тества. Може да се рестартира след 5 минути, в противен случай ще бъде нестабилен и ще повлияе на живота на живачната лампа.
(3) Наблюдение С помощта на синьо-виолетов светлинен филтър под флуоресцентен микроскоп на платформата за обучение може да се види, че клетките, оцветени с 0,01 процента акридиново оранжево флуоресцентно багрило, ядрото и цитоплазмата са възбудени да произвеждат два различни цвята на флуоресценция (тъмно) зелено и оранжево-червено).
