Подготовка и наблюдение на биологични проби за електронна микроскопия
Разделителната способност на микроскопа зависи от дължината на вълната на използваната светлина. Електронният микроскоп, който започва да се появява през 1933 г., използва като източник на светлина електронен лъч с дължина на вълната, много по-къса от тази на видимата светлина, така че разделителната способност, която може да постигне, е значително подобрена в сравнение с тази на оптичния микроскоп. Разликата в източниците на светлина също определя редица разлики между електронните микроскопи и оптичните микроскопи.
Съгласно разликите в принципите на изобразяване с електронен лъч и различните начини на въздействие върху пробите, съвременните електронни микроскопи са се развили в много видове. В момента най-често използваните са трансмисионни електронни микроскопи и сканиращи електронни микроскопи. Общото увеличение на първото може да бъде между 1000-1000000. Общото увеличение на последното може да варира между 20 и 300,000 пъти. Този експеримент представя основно подготовката на два вида микроскопски проби, трансмисионен електронен микроскоп и сканиращ електронен микроскоп.
2. Оборудване
1. Бактерии Ешерихия коли (Ешерихия коли) наклон.
2. Разтвор или реагент амилацетат, концентрирана сярна киселина, абсолютен етанол, стерилна вода, 2% воден разтвор на натриев фосфоволфрамат (pH 6.5-8.0), 0.3% полиетилен разтвор на формалдехид (разтворим в хлороформ), клетъчен пигмент c, амониев ацетат, плазмид pBR322.
3. Инструменти или други прибори: обикновен оптичен микроскоп, медна мрежа, порцеланова фуния, чаша, чиния, стерилен капкомер, стерилни пинсети, карфици, предметни стъкла, дъска за броене, машина за вакуумно покритие, сушилня за критична точка и др.
3. Стъпки на операцията
(1) Подготовка на проби и наблюдение за трансмисионна електронна микроскопия
1. Обработка на метална мрежа
Пробата за оптична микроскопия се поставя върху предметно стъкло за наблюдение. Въпреки това, в трансмисионната електронна микроскопия, тъй като електроните не могат да проникнат през стъкления лист, мрежестите материали могат да се използват само като носители, обикновено наричани носещи мрежи. Носещата мрежа може да бъде разделена на много различни спецификации поради различните материали и форми, сред които най-често използваната е 200-400 мрежа (брой дупки) медна мрежа. Медната мрежа трябва да се третира преди употреба, за да се отстранят замърсяванията и да се поддържа чиста, в противен случай това ще повлияе на качеството на поддържащия филм и яснотата на снимките на образците. Този експеримент използва 400-мрежеста медна мрежа, която може да се третира по следния начин: първо я накиснете и избелете с амилацетат за няколко часа, след това я изплакнете с дестилирана вода няколко пъти и след това я накиснете в абсолютен етанол за дехидратация. Ако медната мрежа все още не е чиста след горните методи, можете да я накиснете в разредена концентрирана сярна киселина (1:1) за 1 до 2 минути или да я сварите в 1% разтвор на NaOH за няколко минути, да я изплакнете с дестилирана вода няколко пъти и след това го поставете в безводен дехидратирайте в етанол и оставете настрана.
2. Подготовка на поддържаща мембрана
Когато наблюдавате проби, носещата мрежа също трябва да бъде покрита със слой от неструктуриран, равномерен филм, в противен случай малки проби ще изтекат от отворите на носещата мрежа. Този филм обикновено се нарича поддържащ филм или носещ филм. Поддържащият филм трябва да е електронно прозрачен и дебелината му обикновено трябва да бъде по-малка от 20 nm; под въздействието на електронния лъч, филмът също трябва да има определена механична якост, за да поддържа структурна стабилност и да има добра топлопроводимост; в допълнение поддържащата мрежа трябва да се използва при електронна микроскопия. Не трябва да има видима структура отдолу, никаква химическа реакция с носената проба и никаква намеса при наблюдението на пробата. Дебелината му обикновено е около 15 nm. Поддържащият филм може да бъде пластмасов филм (като колодиев филм, полиетилен формалдехиден филм и др.), въглероден филм или метален филм (като берилиев филм и др.). При нормални работни условия пластмасовото фолио може да отговори на изискванията. Сред пластмасовите фолиа колодиевият филм е сравнително лесен за приготвяне, но силата му не е толкова добра, колкото полиетилен формалдехидно фолио.
