Характеристики и приложения на лазерен конфокален микроскоп
Докато в нормалния микроскоп равнината на изображението на наблюдението е изолирана от съседните аксиални равнини чрез припокриване на фокалната равнина на лещата на обектива с детектора, в конфокалния микроскоп тази изолация се постига чрез осветяване на пробата с точка, ограничена от дифракция светлина и филтриране на разсеяна светлина чрез използване на дупка по пътя на събраната светлина в спрегнатия фокус на тази светлинна точка, за да се постигне тази изолация и по този начин да се подобри разделителната способност.
Само светлината, отразена обратно от конюгатния слой на пробата, може да премине през дупката в пътя на събирателната светлина, докато останалите неподходящи отражения на слоя на пробата се блокират от дупката. Това дава значително увеличение на разделителната способност. По-долу е показано едно до друго сравнение на многомерна флуоресцентна микроскопия и конфокална микроскопия на една и съща дебела проба. Когато се заснемат поредица от изображения в различни фокални равнини, се получава изображение, обикновено наричано "z-стек", което показва печалбите на разделителната способност и контраста, осигурени от конфокалната микроскопия, и основните причини за тези печалби. Може да се види, че изследването на изображението в горната част на стека, където равнината на изображението е над тъканта, разкрива голямо количество разсеяна светлина във флуоресцентното изображение, докато изображението на конфокалния микроскоп изглежда черно. Това намаление на PSF в аксиална посока директно допринася за разликата в разделителната способност, наблюдавана при оптичния интерфейс в средата на z-стека.
Оптично сканиране на изображения
Друга характеристика на лазерната сканираща конфокална микроскопия е, че това е техника за сканиране на изображения. Традиционните техники за осветяване с широко поле осветяват цялата проба, така че изображението да може да бъде уловено директно с просто око или детектор, но LSCM използва един или повече фокусирани лъча светлина за сканиране през пробата, така че полученото изображение се нарича оптичен срез, както е показано на следващата диаграма. Разликата между традиционното осветяване с широко поле и конфокалното осветяване с лазерно сканиране е показана по-долу.
Ето защо на фигурата по-долу е показан практичен начин за модерна конфокална микроскопия. Възбуждащата светлина от лазера преминава през дихроично огледало и се сканира през двойка галванометърни огледала в x-посоката и y-посоката на пробата, а възбуждането (или отражението) на пробата преминава през дупка в PMT детектор, който да бъде записан, и записаното сканирано изображение се реконструира от компютър, за да се получи действително изображение на пробата.
