Познаване на конфокалния флуоресцентен микроскоп
Основният принцип на конфокалната флуоресцентна микроскопия: точков източник на светлина се използва за облъчване на образеца, образувайки малка, добре дефинирана светлинна точка във фокалната равнина; флуоресценцията, излъчвана от тази точка след облъчване, се събира от лещата на обектива и се изпраща обратно по оригиналния път на светлината на облъчване към разделителя на лъчи, състоящ се от двупосочно хроматично огледало. Разделителят на лъча изпраща флуоресценцията директно към детектора. Както източникът на светлина, така и детекторът имат дупка пред себе си, наречена съответно дупка за осветяване и дупка за откриване. И двете имат една и съща геометрия, около 100-200 nm, и са спрегнати по отношение на светлинната точка във фокалната равнина, т.е. светлинната точка преминава през серия от лещи и в крайна сметка може да бъде фокусирана както върху осветяващата и детекторни дупки. По този начин светлината от фокалната равнина може да се събира в отвора на сондата, докато разсеяната светлина отгоре или под фокалната равнина се блокира извън отвора на сондата и не може да бъде изобразена. Лазерът сканира пробата точка по точка и фотоумножителната тръба след откриване на дупката също получава конфокално изображение на съответната светлинна точка точка по точка, което се преобразува в цифров сигнал и се предава на компютъра, и накрая се събира в ясен конфокално изображение на цялата фокална равнина на екрана.
Всяко изображение във фокална равнина всъщност е оптично напречно сечение на образеца и това оптично напречно сечение винаги има определена дебелина, известна също като оптичен лист. Тъй като интензитетът на светлината във фокусната точка е много по-голям от този в нефокалната точка и светлината от нефокалната равнина се филтрира от дупката, дълбочината на рязкост на конфокалната система се приближава до нула и сканирането по посока на Z-ос позволява оптичната томография да формира двуизмерен оптичен срез на образеца, който да се наблюдава във фокусното петно. Комбинирайки сканиране на XY равнина (фокална равнина) със сканиране по Z-ос (оптична ос), може да се получи триизмерно изображение на пробата чрез натрупване на последователни слоеве от двуизмерни изображения, които се обработват от специализиран компютърен софтуер.
Това означава, че отворът за откриване и отворът на светлинния източник винаги са фокусирани в една и съща точка, така че флуоресценцията, възбудена извън фокалната равнина, не може да влезе в отвора за откриване.
Принципът на работа на конфокалния лазер е просто изразен, че той използва лазер като източник на светлина, на базата на традиционни изображения с флуоресцентен микроскоп, допълнително устройство за лазерно сканиране и конюгирано фокусиращо устройство, чрез компютърно управление за извършване на система за получаване и обработка на цифрови изображения.
