Директно броене на микроорганизми с микроскоп
Експериментален принцип
Директното броене под микроскоп с помощта на хемоцитометър е често използван метод за микробно броене. Предимството на този метод е, че е интуитивен и бърз. Поставете подходящо разредената бактериална суспензия (или суспензия от спори) в камерата за броене между предметното стъкло и покривното стъкло на хемоцитометъра и пребройте под микроскоп. Тъй като обемът на камерата за броене е фиксиран (0.1mm2), той може да се преобразува в общия брой микроорганизми на единица обем според броя на микроорганизмите, наблюдавани под микроскопа. Тъй като този метод преброява сумата от живи и мъртви бактерии, той се нарича още метод за общо броене на бактерии.
Хемоцитометърът обикновено е специално предметно стъкло, върху което четири жлебове образуват три платформи. Платформата в средата е разделена на две половини с къс хоризонтален жлеб. На платформата от всяка страна е гравирана решетка. Всяка мрежа е разделена на девет големи квадрата. Големият квадрат в средата е залата за преброяване. Микроорганизмите се преброяват в камерата за броене. Структурата на таблото за броене на кръвни клетки е показана на фигура Ⅷ-1.
Скалата на помещението за преброяване обикновено има две спецификации, едната е, че голям квадрат е разделен на 16 средни квадрата, а всеки среден квадрат е разделен на 25 малки квадрата (Фигура Ⅷ-2); другият е голям квадрат. Квадратът е разделен на 25 средни квадрата, а всеки среден квадрат е разделен на 16 малки квадрата (Фигура Ⅷ-1, C). Но независимо от вида на дъската за броене, броят на малките квадратчета във всеки голям квадрат е един и същ, т.е. 16×25=400 малки квадратчета, както е показано на фигура Ⅷ-2.
Дължината на страната на всеки голям квадрат е 1 mm, а площта на всеки голям квадрат е 1 mm2. След като покривното стъкло е покрито, височината между предметното стъкло и покривното стъкло е 0.1 mm, така че обемът на камерата за броене е 0.1 mm3.
Когато броите, обикновено пребройте общия брой бактерии в петте средни решетки, след това получете средната стойност на всяка средна решетка и след това умножете по 16 или 25, за да получите общия брой бактерии в голяма решетка, и след това преобразувайте в общ брой бактерии в 1 ml бактериален разтвор.
Лабораторно оборудване
Хемоцитометър, микроскоп, покривно стъкло, стерилен капиляр;
Експериментални материали
Saccharomyces cerevisiae суспензия
Експериментална процедура (метод на директно броене с микробиален микроскоп)
1. разреждане
Правилно разредете суспензията на Saccharomyces cerevisiae. Ако бактериалният разтвор не е гъст, не е необходимо да се разрежда.
2. Стая за микроскопско броене
Преди да добавите проби, извършете микроскопска проверка на камерата за броене на плаката за броене. Ако има мръсотия, тя трябва да се почисти преди броенето.
3. добавете проба
Покрийте чистата и суха хемоцитометърна плака с покривно стъкло и след това използвайте стерилен капкомер с фина уста, за да капнете малка капка от разредения разтвор на Saccharomyces cerevisiae от ръба на покривното стъкло (не много), така че разтворът на бактериите е близо до пролуката по пролуката. Капилярната осмоза навлиза в камерата за броене сама и общата камера за броене може да се напълни с бактериална течност. Внимавайте да няма въздушни мехурчета.
4. микроскопско броене
След почивка в продължение на 5 минути, поставете хемоцитометъра на стола на микроскопа, първо използвайте леща с ниска мощност, за да намерите местоположението на камерата за броене, и след това превключете на леща с висока мощност за броене. Ако се установи, че бактериалният разтвор е твърде гъст или твърде рядък преди преброяване, е необходимо да се коригира отново разреждането преди преброяване. Обикновено разреждането на пробата изисква около 5-10 бактерии във всяка клетка. Всяка камера за броене избира бактериите в 5 средни решетки (по избор 4 ъглови и централни решетки) за броене. Бактериите на линията на мрежата обикновено се броят само на горната и дясната линия. В случай на пъпкуване на дрожди, когато размерът на тялото на пъпката достигне половината от майчината клетка, пребройте две бактерии. Пребройте проба, за да изчислите бактериалното съдържание на пробата от стойностите, преброени в двете камери за броене.
5. Почистване на хемоцитометъра
След употреба изплакнете плочата за броене на кръвни клетки на крана с водна струя, не я мийте с твърди предмети и я изсушете сами или със сешоар след измиване. Микроскопско изследване, наблюдавайте дали във всяка клетка има остатъчни бактерии или други утайки. Ако не е чист, трябва да се мие многократно, докато стане чист.
