Разлика между флуоресцентен микроскоп и нормален микроскоп
Наскоро се опитах да направя няколко замразени части от мишки. След това ще използвам флуоресцентен микроскоп, за да видя дали вирусът, който инжектирах, е в областта на мозъка, която искам. Някои основни принципи на флуоресцентната микроскопия трябва да бъдат научени накратко и аз ще ги споделя тук.
Флуоресцентните микроскопи използват ултравиолетова светлина като източник на светлина за осветяване на обекта, който се проверява, карайки обекта да излъчва светлина и след това да наблюдава обекта под микроскопа. Използва се главно за имунофлуоресцентни клетки. Състои се главно от източник на светлина, система от филтърни плочи и оптична система. Флуоресцентното изображение на пробата се наблюдава чрез увеличението на окуляра и обектива. Нека да разгледаме разликата между флуоресцентен микроскоп и обикновен оптичен микроскоп.
1. Погледнете метода на осветление
Методът на осветяване на флуоресцентния микроскоп обикновено е епи-осветяване, което означава, че източникът на светлина се поставя върху тестовата проба през лещата на обектива.
2. Погледнете резолюцията
Флуоресцентните микроскопи използват ултравиолетова светлина като източник на светлина, която има по-къса дължина на вълната, но по-висока разделителна способност от обикновените оптични микроскопи.
3. Разлики във филтрите
Флуоресцентните микроскопи използват два специални филтъра, единият се използва пред източника на светлина, за да филтрира видимата светлина, и един, използван между лещата на обектива и окуляра, за да филтрира ултравиолетовите лъчи, които могат да предпазят човешките очи.
Флуоресцентният микроскоп също е вид оптичен микроскоп. Основната причина е, че дължината на вълната, възбуждана от флуоресцентния микроскоп, е къса, така че това води до разлика в структурата и употребата между флуоресцентния микроскоп и обикновения микроскоп. Повечето флуоресцентни микроскопи имат добра функция за улавяне на слаба светлина. , така че способността му за изобразяване също е добра при изключително слаба флуоресценция. В съчетание с непрекъснатото усъвършенстване на флуоресцентните микроскопи през последните години, шумът също е значително намален. Поради това се използват все повече и повече флуоресцентни микроскопи.
Познания за двуфотонна флуоресцентна микроскопия
Основният принцип на двуфотонното възбуждане е: при условие на висока фотонна плътност, флуоресцентните молекули могат да абсорбират два фотона с дълга дължина на вълната едновременно и след кратък живот във така нареченото възбудено състояние да излъчват фотон с по-къса дължина на вълната . ;Ефектът е същият като използването на фотон с дължина на вълната, наполовина по-малка от дългата, за възбуждане на флуоресцентни молекули. Двуфотонното възбуждане изисква висока фотонна плътност. За да не се увреждат клетките, двуфотонните микроскопи използват високоенергийни импулсни лазери със заключен режим. Този лазер излъчва лазерна светлина с висока пикова енергия и ниска средна енергия, с ширина на импулса от само 100 фемтосекунди и честота от 80 до 100 MHz. Когато се използва обектив с висока цифрова апертура за фокусиране на фотоните на импулсния лазер, плътността на фотоните във фокуса на обектива е най-висока. Двуфотонното възбуждане възниква само във фокуса на лещата на обектива, така че двуфотонният микроскоп не изисква конфокална дупка, което подобрява ефективността на откриване на флуоресценция.
При общото явление на флуоресценция, поради ниската фотонна плътност на възбуждащата светлина, флуоресцентната молекула може да абсорбира само един фотон едновременно и след това да излъчва един флуоресцентен фотон чрез радиационен преход. Това е еднофотонна флуоресценция. За процеса на възбуждане на флуоресценция, използващ лазер като източник на светлина, могат да се появят двуфотонни или дори многофотонни флуоресцентни явления. В този случай интензитетът на използвания източник на възбуждаща светлина е висок и плътността на фотоните отговаря на изискването флуоресцентните молекули да абсорбират два фотона едновременно. В процеса на използване на обикновени лазери като източници на възбуждаща светлина, плътността на фотоните все още не е достатъчна, за да се получи двуфотонно поглъщане. Обикновено се използват фемтосекундни импулсни лазери, чиято моментна мощност може да достигне мегаватово ниво. Следователно дължината на вълната на двуфотонната флуоресценция е по-къса от дължината на вълната на възбуждащата светлина, което е еквивалентно на ефекта, получен от възбуждане с дължина на вълната на половин възбуждане.
