Тенденция на развитие на конфокалната микроскопия
За да се получат по-добри резултати от наблюдение на техническо ниво, конфокалната микроскопия се фокусира върху подобряване на техническото ниво от аспектите на подобряване на разделителната способност, намаляване на фототоксичността, увеличаване на скоростта на сканиране, наблюдение на дебели проби и наблюдение in vivo. В момента е ефективно Z. Това, което насърчава Zda за технологията за конфокална микроскопия, е микроскопията с ултрависока разделителна способност, която преодолява оптичните граници и позволява на изследователите да получат по-фини клетъчни структури, което е благоприятно за по-задълбочено разбиране на жизнените дейности от изследователите. Следващият изследователски фокус на технологията за конфокална микроскопия трябва да се фокусира върху следните точки:
1. По-бърза скорост на сканиране
Понастоящем скоростта на конфокалното сканиране е ограничена от механичната структура на оборудването за сканиране и разделителната способност може да бъде пожертвана само за постигане на по-висока скорост на сканиране. Много биологични процеси са толкова бързи, че остават неоткриваеми.
2. По-съвършена технология с ултрависока резолюция
Понастоящем технологиите с ултрависока разделителна способност включват STORM, PALM, STED и SSIM с разделителни способности, вариращи от 20 до 200 nm, но всяка технология има определени дефекти, като обработка на проби, посока на Z-ос, фототоксичност и т.н. не е почти съвършен и често е трудно да се постигне граничната разделителна способност при реално наблюдение.
3. По-силна съвместимост
Технологията на конфокалната микроскопия включва различни методи на възбуждане, като например многофотонното и светлинно наблюдение, споменато по-горе, и кохерентното анти-Стоксово раманово разсейване може теоретично да споделя набор от лазерни системи. Микроскопията със супер разделителна способност може да бъде съчетана с бяла лазерна технология. Въпреки това, поради проблемите с патентите на различни компании, все още има място за подобрение по отношение на пълнотата и съвместимостта и текущото оборудване не може да даде пълноценно представяне на техническите предимства на приложението.
Принципи на конфокалната микроскопия
Конфокалният микроскоп се състои от четири части: оптична система на микроскопа, източник на лазерна светлина, скенер и система за откриване и обработка. Той използва лазер с добра кохерентност като източник на светлина. Той приема принцип на конюгатно фокусиране и устройство на базата на традиционен оптичен микроскоп и използва компютърен набор от система за наблюдение, анализ и изход за обработка на изображения.
Лазерният сканиращ лъч преминава през отвора на решетката, за да образува точков източник на светлина, който се отразява към лещата на обектива през разделителя на лъча, фокусира се върху образеца и се сканира. След като пробата бъде възбудена, излъчената флуоресценция се връща към спектроскопа и я събира в отвора за откриване, след което се преобразува в електрически сигнал от фотоумножителната тръба и се предава на компютъра, за да покаже ясно изображение във фокалната равнина. Възбуждащата светлина се фокусира върху пробата през отвора на решетката, а флуоресценцията се фокусира върху отвора през лещата на обектива. Този процес образува две фокусировки, така че се нарича конфокален микроскоп.
Обикновените биологични проби имат сложна структура и определена дебелина. Когато се наблюдава с обикновен флуоресцентен микроскоп, флуоресценцията, излъчвана от пробата, се припокрива една с друга и разделителната способност на изображението е значително намалена.
Конфокалното изображение на конфокалния микроскоп може ефективно да потисне навлизането в детектора на разсеяната светлина и светлината, която не е за измерване, извън фокалната равнина, да реализира изображение на единична фокална равнина и значително да подобри разделителната способност. Когато платформата се движи равномерно в хоризонтална посока, тя може да формира ясно еднослойно изображение, а във вертикална посока може да реализира сканирането слой по слой на пробата на различни дълбочини и да получи триизмерна структура на пробата след триизмерна реконструкция, която е т. нар. „оптичен КТ“. Пробата се маркира с флуоресцентна сонда и след това се наблюдава с конфокален микроскоп. Не само могат да се наблюдават различни фиксирани клетки и тъканни структури, но също така морфологията, структурата и йоните на живите клетки могат да бъдат качествено и количествено наблюдавани и редовно измервани.
