Сравнение между конфокален микроскоп и обикновен оптичен микроскоп
Общ оптичен микроскоп
Общият биологичен микроскоп се състои от три части, а именно: ① система за осветяване, включително източник на светлина и кондензатор; ② Системата за оптично усилване, която се състои от обективна леща и окуляр, е основното тяло на микроскопа. За да се елиминират сферичната аберация и хроматичната аберация, както окулярът, така и обективът са съставени от сложни групи лещи; (3) механично устройство, използвано за фиксиране на материали и удобно наблюдение.
Дали изображението на микроскопа е ясно или не зависи не само от увеличението, но и от разделителната способност на микроскопа. Разделителната способност се отнася до способността на микроскопа (или мястото, където човешките очи са на 25 см от целта) да различи малкия интервал на обекта zui. Разделителната способност зависи от дължината на вълната на светлината, отношението на апертурата и индекса на пречупване на средата, който се изразява с формулата:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Където: n= индекс на пречупване на средата;=огледален ъгъл (ъгълът на отваряне на образеца спрямо отвора на лещата) и NA= цифрова апертура. Ъгълът на огледалото винаги е по-малък от 180? Следователно стойността zui на sina/2 трябва да бъде по-малка от 1.
Коефициентът на пречупване на стъклото, използвано за направата на оптични лещи, е 1,65~1,78, а индексът на пречупване на използваната среда е по-близо до този на стъклото, толкова по-добре. За лещите на сухия обектив средата е въздух и съотношението на диафрагмата обикновено е 0.05 ~ 0,95; Маслената леща използва ароматен асфалт като среда и скоростта на отваряне на лещата може да бъде близо до 1,5.
Дължината на вълната на обикновената светлина е 400~700nm, така че разделителната способност на микроскопа е не по-малка от 0,2μm, а разделителната способност на човешкото око е 0,2mm, така че голямото увеличение на zui, проектирано от общият микроскоп обикновено е 1000X x.
Защо ви е необходим конфокален микроскоп?
1. Оптичният микроскоп е усъвършенстван чрез усилията и усъвършенстването на нашите велики предшественици. Всъщност обикновените микроскопи могат да ни осигурят красиви микроскопични изображения просто и бързо. Въпреки това се случи събитие, което донесе революционна иновация в този почти перфектен свят на микроскопи, което е изобретяването на "лазерно сканиращ конфокален микроскоп". Този нов микроскоп се характеризира с приемането на оптична система, която извлича информацията за изображението само в равнината, където е концентриран фокусът, и възстановява получената информация в паметта на изображението, докато променя фокуса, така че ярко изображение с пълна триизмерна информация може да се получи. Чрез този метод може лесно да се получи информация за формата на повърхността, която не може да бъде потвърдена с обикновени микроскопи. Освен това за обикновените оптични микроскопи „подобряването на разделителната способност“ и „задълбочаването на дълбочината на фокуса“ са противоречиви условия, особено при голямо увеличение, но за конфокалните микроскопи този проблем е решен.
2. Предимства на конфокалната оптична система
Конфокалната оптична система осветява точката на пробата, а отразената светлина също се приема от точковите рецептори. Когато пробата се постави във фокусна позиция, почти цялата отразена светлина може да достигне до фоторецептора, но когато пробата се отклони от фокуса, отразената светлина не може да достигне до фоторецептора. Тоест, в конфокалната оптична система само изображението, което съвпада с фокуса, ще бъде изведено, а факулата и безполезна разсеяна светлина ще бъдат екранирани.
3. Защо да използваме лазер?
В конфокалната оптична система пробата се осветява и отразената светлина също се приема от точков фоторецептор. Следователно точковият източник на светлина става необходим. Лазерът принадлежи към много точков източник на светлина. В повечето случаи източникът на светлина на конфокалния микроскоп приема лазерен източник на светлина. В допълнение, характеристиките на лазера, като монохроматичност, насоченост и отлична форма на лъча, също са важни причини за широкото му използване.
4. Става възможно наблюдение в реално време, базирано на високоскоростно сканиране.
При лазерното сканиране акустичният оптичен дефлектор (AO първичен елемент) се използва в хоризонтална посока, а Servo Galvano-огледалото се използва във вертикална посока. Тъй като в модула за акустично оптично отклонение няма механична вибрационна част, той може да сканира с висока скорост и е възможно да се наблюдава в реално време на екрана за наблюдение. Високата скорост на тази камера е много важен проект, който пряко влияе върху скоростта на фокусиране и извличане на позиция.
5. Връзка между позицията на фокуса и яркостта
В конфокалната оптична система, когато пробата е правилно поставена във фокусна позиция, яркостта е голяма, а преди и след нея нейната яркост ще спадне рязко (плътна линия на фигура 4). Тази чувствителна селективност на фокалната равнина също е принципът за измерване на посоката на височина на конфокалния микроскоп и разширяване на фокалната дълбочина. Обратно, обикновеният оптичен микроскоп няма очевидна промяна на яркостта преди и след позицията на фокуса (пунктирана линия на фигура 4).
6. Висок контраст и висока резолюция
В общия оптичен микроскоп отразената светлина, отклоняваща се от фокуса, ще пречи и ще се припокрива с частта за фокусиране на изображения, като по този начин намалява контраста на изображението. За разлика от това, в конфокалната оптична система, разсеяната светлина извън фокуса и разсеяната светлина вътре в лещата на обектива са почти напълно премахнати, така че може да се получи изображение с много висок контраст. Освен това, тъй като светлината преминава през лещата на обектива два пъти, точковото изображение първо се изостря и резолюцията на микроскопа също се подобрява.
7. Функция за оптична локализация
В конфокалната оптична система отразената светлина от частта, различна от фокусната точка, е екранирана от микропори. Следователно, когато се наблюдава триизмерна проба, се формира изображение като това, образувано след нарязване на пробата с фокуса (Фигура 5). Този ефект се нарича оптична локализация, която принадлежи към една от особеностите на конфокалната оптична система.
8. Функция за памет за фокусиране
Така наречената отразена светлина извън фокуса се екранира от микропорите. От друга страна, може да се счита, че всички точки на изображението, образувано от конфокалната оптична система, съвпадат с фокуса. Следователно, ако триизмерната проба се премести по посока на Z-ос (оптична ос), изображението ще се натрупа и съхрани в паметта и zui в крайна сметка ще получи изображението, образувано от съвпадението на цялата проба и фокуса . По този начин функцията за безкрайна дълбочина на фокуса се нарича функция за мобилна памет.
9. Функция за измерване на формата на повърхността
Във функцията за преместване на фокуса повърхностната форма на пробата може да бъде измерена по безконтактен начин чрез добавяне на контур за запис на височина. Въз основа на тази функция е възможно да се запишат координатите на Z-ос, образувани от голямата стойност на яркост на zui във всеки пиксел, и въз основа на тази информация може да се получи информацията, свързана с формата на повърхността на пробата.
10. Функция за измерване на микроразмери с висока точност
Устройството за приемане на светлина приема едноизмерен CCD сензор за изображения, така че да не може да бъде повлияно от наклона на сканиране на сканиращото устройство, така че да може да се извърши измерване с висока точност. Освен това, тъй като функцията за памет за преместване на фокуса с регулируема дълбочина на фокуса се приема едновременно, грешката при измерване, причинена от отместване на фокуса, може да бъде елиминирана.
11. Анализ на триизмерно изображение
С помощта на функцията за измерване на формата на повърхността може лесно да се направи триизмерното изображение на повърхността на пробата. Не само това, но и много видове анализи могат да бъдат извършени, като: измерване на грапавостта на повърхността, площ, обем, повърхностна площ, кръглост, радиус, дължина на zui, периметър, център на тежестта, томографско изображение, FFT трансформация, линия измерване на ширина и така нататък.
Лазерният конфокален сканиращ микроскоп може да се използва не само за наблюдение на морфологията на клетките, но и за количествен анализ на биохимичните компоненти в клетките, статистика на оптичната плътност и измерване на клетъчната морфология.
