Класификация и работа на микроскопи за изследване на клетки
Микроскопът е основният инструмент за наблюдение на клетките. Според различните източници на светлина може да се раздели на две категории: оптични микроскопи и електронни микроскопи. Първият използва видима светлина (UV микроскопите използват ултравиолетова светлина) като източник на светлина, докато вторият използва електронни лъчи като източник на светлина.
-,Оптичен микроскоп
(1) Обикновен оптичен микроскоп
Обикновените биологични микроскопи се състоят от три части, а именно: ① система за осветяване, включително източник на светлина и кондензатор; ② система за оптично увеличение, съставена от обектив и окуляр, който е основното тяло на микроскопа. За да се елиминират сферичната и хроматичната аберация, както окулярът, така и обективът ③Механично устройство, използвано за фиксиране на материала и улесняване на наблюдението (Фигура 2-1).
Дали изображението на микроскопа е ясно не се определя само от увеличението, но и е свързано с разделителната способност на микроскопа. Разделителната способност се отнася до способността на микроскопа (или човешкото око да бъде на 25 см от целта) да различи най-малкото разстояние между обектите. Размерът на разделителната способност се определя от Дължината на вълната и съотношението на апертурата на светлината и индексът на пречупване на средата се изразяват с формулата:
Във формулата: n=индекс на пречупване на средата;=ъгъл на отвора (ъгълът на отваряне на образеца спрямо отвора на лещата на обектива), NA=отвор на лещата (числова апертура). Ъгълът на обектива винаги е по-малък от 180 градуса, така че максималната стойност на sina/2 трябва да бъде по-малка от 1.
Коефициентът на пречупване на стъклото, използвано за направата на оптичната леща, е от 1,65 до 1,78, а индексът на пречупване на използваната среда е по-близо до стъклото, толкова по-добре. За сухите лещи на обектива средата е въздух и съотношението на апертурата на лещата обикновено е 0.05 до 0,95; за маслени лещи кедровото масло се използва като среда, а съотношението на блендата на лещата може да бъде близо до 1,5.
Дължината на вълната на обикновената светлина е {{0}}nm, така че стойността на разделителната способност на микроскопа няма да бъде по-малка от 0.2μm, а разделителната способност на човешкото око е 0,2 mm, така че максималното увеличение на общия дизайн на микроскопа обикновено е 1000X.
(2) Флуоресцентна микроскопия
Някои вещества в клетките, като хлорофила, могат да флуоресцират след облъчване с ултравиолетови лъчи; някои вещества сами по себе си не могат да флуоресцират, но ако са оцветени с флуоресцентни багрила или флуоресцентни антитела, те също могат да флуоресцират при облъчване с ултравиолетови лъчи, а флуоресцентният микроскоп (фиг. 2-2, 3, 4) е един от инструментите за качествени и количествени изследвания на такива вещества.
Флуоресцентните микроскопи и обикновените микроскопи имат следните разлики:
1. Методът на осветяване обикновено е епи-осветяване, т.е. източникът на светлина се проектира върху пробата през лещата на обектива (Фигура 2-3);
2. Източникът на светлина е ултравиолетова светлина, дължината на вълната е по-къса и разделителната способност е по-висока от тази на обикновените микроскопи;
3. Има два специални филтъра, единият пред източника на светлина се използва за филтриране на видимата светлина, а този между окуляра и лещата на обектива се използва за филтриране на ултравиолетовата светлина за защита на очите.
(3) Лазерно сканиращ конфокален микроскоп
Лазерният конфокален сканиращ микроскоп (лазерен конфокален сканиращ микроскоп, Фигура 2-5, 6) използва лазер като източник на сканираща светлина и сканира изображения точка по точка, линия по линия, повърхност по повърхност, а сканиращият лазер и флуоресцентната колекция споделят обектив, а фокусът на обектива е. Фокусната точка на сканиращия лазер също е обектна точка на моментално изобразяване. Тъй като дължината на вълната на лазерния лъч е къса и лъчът е много тънък, конфокалният лазерен сканиращ микроскоп има по-висока разделителна способност, която е около 3 пъти по-голяма от обикновения оптичен микроскоп. Системата се фокусира веднъж и сканирането е ограничено до една равнина на пробата. Когато дълбочината на фокусиране е различна, могат да се получат изображения на различни нива на дълбочина на пробата. Информацията за тези изображения се съхранява в компютъра. Чрез компютърен анализ и симулация може да се покаже триизмерната структура на клетъчната проба.
Конфокалната лазерна сканираща микроскопия може да се използва не само за наблюдение на клетъчната морфология, но и за количествен анализ на вътреклетъчни биохимични компоненти, статистика на оптичната плътност и измерване на клетъчната морфология.
(4) Микроскоп с тъмно поле
Микроскопът с тъмно поле (микроскоп с тъмно поле, Фигура 2-7) има светлинен лист в центъра на кондензатора, така че осветената светлина да не влиза директно в човешката леща, а само светлината, отразена и дифрактирана от образеца е позволено да влезе в лещата на обектива, така че фонът на зрителното поле е черен, краищата на обектите са светли. С помощта на този микроскоп могат да се видят частици с размери до 4-200nm, а разделителната способност може да бъде 50 пъти по-висока от тази на обикновените микроскопи.
(5) Микроскоп с фазов контраст
Фазово-контрастен микроскоп (фазово-контрастен микроскоп, фигура 2-8, 9) от П. Зернике е изобретен през 1932 г. и печели Нобелова награда по физика през 1953 г. за него. Най-голямата характеристика на този микроскоп е, че може да наблюдава неоцветени проби и живи клетки.
Основният принцип на фазово-контрастната микроскопия е да се промени оптичната разлика в пътя на видимата светлина, преминаваща през образеца, в амплитудна разлика, като по този начин се подобрява контрастът между различните структури и правят различните структури ясно видими. След като премине през образеца, светлината се пречупва, отклонява се от първоначалния оптичен път и се забавя с 1/4λ (дължина на вълната). Увеличете, увеличете или намалете амплитудата, увеличете контраста. По отношение на структурата фазово-контрастните микроскопи имат две специални характеристики, които се различават от обикновените оптични микроскопи:
1. Пръстеновидната диафрагма е разположена между източника на светлина и кондензатора и нейната функция е да накара светлината, преминаваща през кондензатора, да образува кух светлинен конус и да се фокусира върху образеца.
2. Фазовата плоча (пръстеновидна фазова плоча) добавя фазова плоча, покрита с магнезиев флуорид в лещата на обектива, което може да забави фазата на директна светлина или дифрактирана светлина с 1/4λ. Има два вида:
①А плюс фазова плоча: Директната светлина се забавя с 1/4λ. След като двете групи светлинни вълни се комбинират, светлинните вълни се събират заедно и амплитудата се увеличава. Структурата на образеца е по-ярка от околната среда, образувайки ярък контраст (или отрицателен контраст).
② B плюс фазова плоча: Дифрактираната светлина се забавя с 1/4λ. След като двата комплекта лъчи се комбинират, светлинните вълни се изваждат и амплитудата става по-малка, образувайки тъмен контраст (или положителен контраст), а структурата е по-тъмна от околната среда.
