Сравнение на различни техники за микроскопия със супер разделителна способност
За конвенционалната светлинна микроскопия дифракцията на светлината ограничава разделителната способност на изображението до приблизително 250 nm. Днес техниките със супер разделителна способност могат да подобрят това с повече от коефициент 10. Тази техника се постига главно чрез три метода: микроскопия за локализиране на една молекула, включително микроскопия за фоточувствителна локализация (PALM) и микроскопия за стохастична оптична реконструкция (STORM); структурирана осветителна микроскопия (SIM); и микроскопия с изчерпване на стимулирани емисии (STED). Как да изберем технология със супер разделителна способност е това, което интересува всеки. „За съжаление, няма прости принципи за вземане на решение кой метод да се използва“, казва Матю Страси, постдокторантски изследовател в Оксфордския университет, Обединеното кралство. "Всеки има своите предимства и недостатъци." Разбира се, учените също измислят как да изберат правилния метод за конкретен проект. „В контекста на биоизобразяването ключовите фактори, които трябва да се вземат предвид, включват: пространствена и времева разделителна способност, чувствителност към фотоувреждане, капацитет за етикетиране, дебелина на пробата и фонова флуоресценция или клетъчна автоложна флуоресценция.“ Как работи Различните микроскопи със супер разделителна способност работят по различни начини. В случая на PALM и STORM само малка част от флуоресцентните маркери се възбуждат или фотоактивират в даден момент, което позволява тяхното независимо локализиране с висока точност. Преминаването през този процес с всички флуоресцентни етикети води до пълно изображение със супер разделителна способност. Щефан Хел, един от носителите на Нобелова награда за химия за 2014 г. и директор на Института по биофизична химия Макс Планк, каза: „Системата PALM/STORM е сравнително лесна за настройка, но е трудна за прилагане, тъй като флуоресцентните групата трябва да има способност за фотоактивиране. Ограничения Недостатъкът е, че те трябва да открият една флуоресцентна молекула в контекста на клетка и са по-малко надеждни от STED." STED използва лазерен импулс за възбуждане на флуорофора и пръстеновиден лазер за потушаване на флуорофора, оставяйки само междинната флуоресценция с нанометров размер за супер разделителна способност. Сканирането на цялата проба създава изображение. „Предимството на STED е, че това е технология с бутони“, обясни Хел. „Той работи като стандартен конфокален флуоресцентен микроскоп.“ Той може също така да изобразява живи клетки, използвайки флуорофори като зелени или жълти флуоресцентни протеини и багрила, получени от родамин. Параметрично сравнение Въпреки че всички техники със супер разделителна способност превъзхождат конвенционалната светлинна микроскопия по отношение на разделителната способност, те се различават една от друга. SIM грубо удвоява разделителната способност до около 100 nm. PALM и STORM могат да разрешават 15 nm цели. Според Хел, STED осигурява пространствена разделителна способност от 30 nm в живи клетки и 15 nm във фиксирани клетки. Когато става дума за конкретни приложения, трябва да вземем предвид и съотношението сигнал/шум. В някои случаи по-ниска разделителна способност, но по-висок SNR може да доведе до по-добро изображение от обратното (по-висока разделителна способност, но по-нисък SNR). Скоростта на получаване на изображение също е много важна, особено за живите клетки. „Всички техники за супер разделителна способност са по-бавни от конвенционалните техники за флуоресцентно изобразяване“, каза Страси. „PALM/STORM е най-бавният, той се нуждае от десетки хиляди кадри, за да получи едно изображение, SIM се нуждае от десетки кадри, а STED е технология за сканиране, така че скоростта на придобиване зависи от размера на зрителното поле.“ В допълнение към живите клетки или фиксираните клетки за изображения, някои учени също искат да разберат как се движат обектите. Страси се интересува от разбирането на динамиката на биологичните системи в живите клетки, а не само от статични изображения. Той комбинира PALM с проследяване на единични частици, за да анализира динамиката в живите клетки. По този начин той може директно да проследи маркерните молекули, докато изпълняват функциите си. Той обаче вярва, че SIM не е подходящ за изучаване на тези динамични процеси на молекулярно ниво, но поради бързата си скорост на придобиване е особено подходящ за наблюдение на динамиката на по-големи структури, като цели хромозоми. Последните резултати През 2017 г. екипът на Hell докладва микроскопа със супер разделителна способност MINFLUX в Science. Според Хел, този метод със супер разделителна способност постига за първи път пространствена разделителна способност от 1 nm. В допълнение, той може да проследява отделни молекули в живи клетки поне 100 пъти по-бързо от други методи. Други учени също се изказаха високо за микроскопа MINFLUX. „Непрекъснато се разработват нови приложения и подходи, но за мен се открояват два напредъка“, каза Шехтман. Единият е MINFLUX. „Използва гениален подход, за да получи много прецизно молекулярно позициониране.“ По отношение на второто вълнуващо развитие Шехтман спомена WE Moerner и неговите колеги от Станфордския университет. Moerner също беше носител на Нобелова награда за химия за 2014 г. Един от победителите. За да се справят с ограничението на разделителната способност на изображенията, причинено от анизотропното разсейване на флуоресцентни единични молекули, учените са използвали различни поляризации на възбуждане, за да определят ориентацията и позицията на молекулите. В допълнение, те имат развити деликатни зенични повърхности. Тези техники подобряват способността за локализиране на структури. Относно флуоресцентните етикети В много приложения със супер разделителна способност етикетите наистина имат значение. Има и някои компании, които предоставят свързани продукти. Например германската Miltenyi се обедини с Abberior, компания, основана от Щефан Хел, за да предостави персонализирани услуги за конюгиране на антитела за багрила за микроскопия със супер разделителна способност. Редица други компании също предлагат съвпадащи маркери. „Нашите нано-бустери са много малки, само 1,5 kDa, и много специфични“, казва Кристоф Екерт, маркетинг директор в ChromoTek. Тези протеини свързват зелени и червени флуоресцентни протеини (GFP и RFP). Те са получени от фрагменти от антитела на алпака, известни като VHH или нанотела, с отлични свързващи свойства и стабилно качество без вариации от партида до партида. Тези маркери са подходящи за различни техники със супер разделителна способност, включително SIM, PALM, STORM и STED. Ai-Hui Tang, асистент в Медицинския факултет на Университета в Мериленд, и колегите му използваха GFP-Booster и STORM на ChromoTek, за да изследват разпространението на информация в нервната система. Те откриха молекулярни нанокластери, наречени наноколони, в пресинаптичните и постсинаптичните неврони. Учените смятат, че тази структура показва, че централната нервна система използва прости принципи за поддържане и регулиране на синаптичната ефективност. Различни версии на изображения със супер разделителна способност и нарастващ брой методи отвеждат учените още по-дълбоко в биологичните мистерии. Като нарушават дифракционната граница на видимата светлина, биолозите могат дори да „следят отблизо“ действията на клетките.
