Какво е двуфотонна флуоресцентна микроскопия
Основният принцип на двуфотонното възбуждане е: в случай на висока фотонна плътност, флуоресцентните молекули могат да абсорбират два фотона с дълга дължина на вълната едновременно и да излъчват фотон с по-къса дължина на вълната след кратък период на така нареченото време на живот във възбудено състояние . ; ефектът е същият като използването на фотон, чиято дължина на вълната е половината от дългата дължина на вълната, за да възбуди флуоресцентна молекула. Двуфотонното възбуждане изисква висока фотонна плътност. За да не се увреждат клетките, двуфотонната микроскопия използва високоенергийни импулсни лазери със заключен режим. Лазерът, излъчван от този лазер, има висока пикова енергия и ниска средна енергия, ширината на импулса му е само 100 фемтосекунди, а честотата му може да достигне 80 до 100 мегахерца. Когато се използва обектив с висока цифрова апертура за фокусиране на фотоните на импулсния лазер, плътността на фотоните във фокусната точка на лещата на обектива е най-висока и двуфотонното възбуждане възниква само във фокусната точка на лещата на обектива, така че двуфотонният микроскоп не се нуждае от конфокална дупка, което подобрява ефективността на откриване на флуоресценция.
При общите явления на флуоресценция, поради ниската фотонна плътност на възбуждащата светлина, флуоресцентната молекула може да абсорбира само един фотон едновременно и след това да излъчва флуоресцентен фотон чрез радиационен преход, който е еднофотонна флуоресценция. За процеса на възбуждане на флуоресценция, използващ лазер като източник на светлина, може да възникне двуфотонна или дори многофотонна флуоресценция. По това време интензитетът на използвания източник на възбуждаща светлина е висок и плътността на фотоните отговаря на изискванията за флуоресцентни молекули, абсорбиращи два фотона едновременно. В процеса на използване на общ лазер като източник на възбуждаща светлина, плътността на фотоните все още не е достатъчна, за да произведе феномена на двуфотонна абсорбция. Обикновено се използва фемтосекунден импулсен лазер, чиято моментна мощност може да достигне от порядъка на мегават. Следователно дължината на вълната на двуфотонната флуоресценция е по-къса от дължината на вълната на възбуждащата светлина, което е еквивалентно на ефекта, получен от възбуждане при половината от дължината на вълната на възбуждане.
