Има са много предимства до два фотона флуоресценция микроскопия
1) Дълга дължина на вълната светлина е по-малко засегнати от разсейване от къса дължина на вълната светлина и може лесно проникват образец % 3b
2) флуоресцентни молекули извън на фокусна равнина са не развълнувани % 2c позволяване повече възбуждане светлина до достигне на фокусна равнина % 2c позволяване на възбуждане светлина да проникват по-дълбоко образци% 3b
3) Дълга дължина на вълната близка инфрачервена светлина е по-малко токсична до клетки от къса дължина на вълната светлина% 3b
4) Когато наблюдение образци използване на a два фотона микроскоп % 2c фотоизбелване и фототоксичност се появят само на на фокусна равнина. Следователно% 2c два фотона микроскопи са повече подходящи от единични фотони микроскопи за наблюдение дебели образци % 2c за наблюдение живи клетки % 2c или за извършване фиксирана точка фотоизбелване експерименти.
Знания за конфокална флуоресценция микроскопия
На основен принцип на confocal флуоресценция микроскопия : Използвайте а точка светлина източник да осветяване на образец да форма а малък % 2c добре дефинирани светлина петно на на фокуса равнина. Флуоресценцията излъчва от на място след е осветен е събран от обектива и върнати към на дихроик огледало заедно оригинала осветление светлина път. представлява а лъч сплитер. Спектрометърът изпраща флуоресценцията директно към детектора. Има е a дупка в отпред на светлината източник и детектора 2c които са наречени на осветление дупка и на откриване дупка съответно . Геометричните размери на двете са последователни% 2c около % 7b% 7b1% 7d% 7dnm% 3b относителен до светлината точка на фокуса равнина % 2c двете са спрегнат% 2c това е % 2c светлината точка преминава през a серия на лещи и може в крайна сметка да бъде фокусиран на на осветление pinhole and the detection pinhole at the same time. In this way, the light from the focal plane can be concentrated within the detection hole, while the scattered light from above or below the focal plane is blocked outside the detection hole and cant be imaged. Пробата е сканирана точка по точка с лазера % 2c и фотомножителя тръба зад откриването дупка също получава конфокално изображение на съответстващо светлина точка точка по точка % 2c което е преобразувано в a цифров сигнал и предадено на компютъра , и е накрая агрегирани на екрана в a ясно конфокално изображение на цялото фокусно равнина .
Всеки фокална равнина изображение е всъщност оптика напречно сечение на образеца Това оптично напречно сечение винаги има а определена дебелина и е също така наречен оптичен тънък раздел . Тъй като светлината интензивност в фокуса е много по-голяма от светлината интензивност в светлината интензивност в на не-фокус% 2c и не-фокална равнина светлина е филтрирана от дупка % 2c дълбочината на поле на конфокална система е приблизително нула. Сканиране заедно оста Z посока може реализиране оптична томография% 2c формиране желаното Наблюдавайте двуизмерното оптично сечение в фокусираното място на пробата Чрез комбиниране X-Y равнина (фокална равнина) сканиране с Z-ос (оптична ос) сканиране% 2c чрез натрупване непрекъснато нива на двуизмерни изображения и обработка тях с специализирани компютър софтуер % 2c a триизмерно изображение на пробата може да бъде получено.
Това е% 2c откриването дупка и светлината източник дупка са винаги фокусирани на същото точка % 2c така това флуоресценция развълнуван извън фокуса равнина не може въведете откриването дупка.
The прост израз на на работа принцип на лазер confocal е че го използва лазер като на светлина източник . На на основа на традиционен флуоресценция микроскоп изображения , a лазер сканиране устройство и а спрегнат фокусиране устройство са добавени% 2c и системата е контролиран от а компютър да събира и процес цифрови изображения.
