Основният метод за наблюдение на оптичния микроскоп е флуоресцентното наблюдение
Феномен на флуоресценция
Флуоресценцията се отнася до процеса, при който флуоресцентно вещество излъчва светлина с по-голяма дължина на вълната почти едновременно, когато е облъчено със светлина с определена дължина на вълната (Фигура 1). Когато светлина с определена дължина на вълната (дължина на вълната на възбуждане) удари молекула (като молекула във флуорофор), фотонната енергия се абсорбира от електроните на молекулата. След това електроните преминават от основно състояние (S0) към по-високо енергийно ниво, възбуденото състояние (S1'). Този процес се нарича възбуждане①. Електронът остава във възбудено състояние за 10-9–10-8 секунди, по време на които електронът губи част от енергията ②. В процеса на напускане на възбуденото състояние (S1) и връщане в основното състояние ③, оставащата енергия, абсорбирана по време на процеса на възбуждане, ще бъде освободена.
Времето на престой на флуоресцентна молекула във възбудено състояние е продължителността на живота на флуоресценцията, обикновено в наносекунди, което е присъща характеристика на самата флуоресцентна молекула. Технологията за изобразяване, използваща продължителността на живота на флуоресценцията, се нарича Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), която може да извършва по-задълбочени функционални и точни измервания в допълнение към изобразяването на интензитета на флуоресценцията, за да се получи молекулярна конформация, междумолекулни взаимодействия и молекулярна микросреда. информация, която е трудно да се получи с конвенционалните оптични изображения.
Друго важно свойство на флуоресценцията е отместването на Стокс, разликата в дължината на вълната между пиковете на възбуждане и излъчване (Фигура 2). Обикновено дължината на вълната на емисионната светлина е по-дълга от дължината на вълната на възбуждащата светлина. Това е така, защото след като флуоресцентното вещество се възбуди и преди фотонът да бъде освободен, електроните ще загубят част от енергията чрез процеса на релаксация. Флуоресцентните вещества с по-големи Стоксови измествания се наблюдават по-лесно под флуоресцентен микроскоп.
Флуоресцентни микроскопи и флуоресцентни филтърни блокове
Флуоресцентната микроскопия е оптичен микроскоп, който използва флуоресцентни свойства за наблюдение и изобразяване и се използва широко в клетъчната биология, невробиологията, ботаниката, микробиологията, патологията, генетиката и други области. Флуоресцентното изобразяване има предимствата на висока чувствителност и висока специфичност и е много подходящо за наблюдение на разпределението на специфични протеини, органели и т.н. в тъкани и клетки, изследване на съвместна локализация и взаимодействие и проследяване на динамиката на живота процеси като промени в концентрацията на йони.
Повечето молекули в клетките не флуоресцират и за да ги видите, те трябва да бъдат флуоресцентно маркирани. Има много методи за флуоресцентно маркиране, които могат да бъдат директно маркирани (като използване на DAPI за маркиране на ДНК) или имунооцветяване с помощта на антиген-свързващите свойства на антителата, или целевият протеин може да бъде белязан с флуоресцентни протеини (като GFP, зелено флуоресцентен протеин), или обратимо свързване. синтетични багрила (като Fura-2) и др.
Понастоящем флуоресцентният микроскоп се е превърнал в стандартно оборудване за изображения на различни лаборатории и платформи за изображения и е добър помощник за нашите ежедневни експерименти. Флуоресцентните микроскопи се разделят основно на три категории: изправени флуоресцентни микроскопи (подходящи за разрези), обърнати флуоресцентни микроскопи (подходящи за живи клетки, като се вземат предвид срезове), флуоресцентни стереоскопични микроскопи (подходящи за по-големи екземпляри, като растения, риба зебра (възрастни/ ембрион), медака, органи на мишка/плъх и др.).
Флуоресцентният филтърен блок е основният компонент на флуоресцентното изобразяване в микроскопи. Състои се от възбуждащ филтър, емисионен филтър и дихроичен светоделител. Инсталира се във филтърното колело, като например Leica DMi8, оборудвано с 6-позиционно филтърно колело (Фигура 3). ). Различните микроскопи имат различни позиции на колелата, а някои микроскопи използват филтърни предметни стъкла.
Филтърният блок играе важна роля във флуоресцентното изобразяване: възбуждащият филтър избира възбуждащата светлина, за да възбуди пробата, и блокира други дължини на вълните на светлината; светлината, преминаваща през възбуждащия филтър, преминава през дихроичен лъчеделител (неговата роля е да отразява възбуждащата светлина и да предава флуоресценцията). След отражението тя се фокусира от лещата на обектива, облъчва се в пробата и съответната флуоресценция се възбужда до излъчват светлина. Излъчената светлина се събира от лещата на обектива, преминава през дихроичния разделител на лъча и достига до емисионния филтър. Както е показано на Фигура 4: дължината на вълната на възбуждане е 450-490nm, дихроичният разделител на лъчи отразява светлина, по-къса от 510nm, предава светлина, по-дълга от 510nm, и обхватът на получаване на емисионна светлина е 520-560nm.
Флуоресцентните филтри, които обикновено се използват във флуоресцентните микроскопи, могат да бъдат разделени на два типа: дългопропускащи (LP за къси) и лентови (BP за къси). Лентата обикновено се определя от централната дължина на вълната и ширината на интервала, като например 480/40, което означава, че може да бъде пропусната светлина от 460-500nm. Дългопропускащите филтри, като 515 LP, пропускат светлина с дължини на вълните, по-дълги от 515 nm (Фигура 5).
Флуоресцентните вещества имат своя характерна крива на възбуждане (абсорбция) и крива на излъчване, пикът на възбуждане е идеалната дължина на вълната на възбуждане (висока ефективност на възбуждане, което може да намали енергията на възбуждащата светлина, защитава клетките и багрилата), а кривата на емисиите е дължината на вълната на флуоресценцията на емисиите диапазон. Следователно в експеримента ще изберем дължината на вълната възможно най-близо до пика на възбуждане за възбуждане, а диапазонът на приемане трябва да включва пика на емисиите. Например, пикът на възбуждане на Alexa Fluor 488 е 500 nm, а филтърът на възбуждане от 480/40 може да бъде избран във флуоресцентния микроскоп.
Подробности за филтърните кубове могат да се видят в софтуера за изображения на микроскоп. Разбирането на багрилата и намирането на филтъра, който най-добре отговаря на вашата проба, е от решаващо значение за флуоресцентното изобразяване. Спектралната информация на флуоресцентните багрила и флуоресцентните протеини обикновено е посочена в инструкциите и може да бъде намерена и онлайн.
В допълнение към дължините на вълните на възбуждане и излъчване на флуоресцентни сонди, изборът на филтърни блокове също трябва да вземе предвид дали има неспецифично възбуждане и дали има кръстосан цвят за многоцветно маркирани проби. Освен това е необходимо да се вземе предвид използвания източник на флуоресцентна светлина. Понастоящем често използваните флуоресцентни източници на светлина включват живачни лампи, металхалогенни лампи и LED източници на светлина, които се развиха бързо през последните години. Спектърът на флуоресцентен източник на светлина е непрекъснат или прекъснат и енергията ще бъде различна в различните ленти с дължина на вълната. Светодиодният източник на светлина постепенно се превръща в основен източник на светлина на флуоресцентния микроскоп поради относително тясната си спектрална лента, по-стабилен енергиен изход, дълъг живот, по-безопасна и опазваща околната среда и много други предимства.
В допълнение към вградения филтърен блок на микроскопа има и външно бързо колело (Фигура 7). Скоростта на преобразуване на филтъра, съседен на външното бързо колело на Leica, е 27 ms, което може да реализира високоскоростни многоцветни експерименти, като FRET и Fura2 съотношение на калциеви изображения. (фиг. 8) и др.
Голямо разнообразие от техники за изобразяване на флуоресцентна микроскопия
За да се посрещнат различни нужди от флуоресцентни изображения, в допълнение към флуоресцентните микроскопи са разработени различни решения за изображения с флуоресцентна микроскопия:
Широкообхватни системи за изображения с висока разделителна способност, като Leica THUNDER Imager, използват иновативната Clearing технология на Leica за ефективно премахване на сигнали за смущения от нефокална равнина по време на изображения, представяйки ясни изображения и предимствата на високоскоростните изображения;
Конфокалният лазерен сканиращ микроскоп използва дупки за елиминиране на смущенията на нефокалната равнина, реализира оптично разделяне и получава изображения с висока разделителна способност и триизмерни изображения;
Микроскопи с ултрависока разделителна способност и наномикроскопи, които преминават границата на дифракция, могат да наблюдават фини структури, по-малки от 200 nm;
Многофотонна система за изобразяване, използваща принципа на многофотонно възбуждане за изобразяване на плътна тъкан и дълбоко in vivo;
Технология за изобразяване на леки листове с висока времева и пространствена разделителна способност, бърза скорост на изобразяване, висока разделителна способност, ниска фототоксичност, особено подходяща за изследване на развитието и in vivo динамично наблюдение;
Доживотното флуоресцентно изображение (FLIM), което не се влияе от фактори като концентрация на флуоресцентно вещество, фотоизбелване, интензитет на възбуждащата светлина и др., може да извършва по-задълбочени функционални и точни измервания;
Флуоресцентна корелационна спектроскопия (FCS) и флуоресцентна кръстосана корелационна спектроскопия (FCCS) измерват молекулния брой и коефициента на дифузия на флуоресцентните молекули, като по този начин анализират молекулната концентрация, молекулния размер, вискозитета, молекулното движение, молекулярното свързване/дисоциация и молекулярните оптични свойства;
Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRF), с изключително висока разделителна способност по z-ос, е идеална за изследване на молекулярната структура и динамиката на повърхностите на клетъчните мембрани.
