Техники на оцветяване и микроскопско наблюдение на микроорганизми
1. Цел
1.1 Научете основните техники за микробни намазки и оцветяване.
1.2 Овладейте простия метод на оцветяване на бактериите.
1.3 Предварително разберете морфологичните характеристики на бактериите и консолидирайте знанията за това как да използвате маслени лещи и асептични техники за работа.
2 Принципи
Намазването и оцветяването на бактерии е основна техника в микробиологичните експерименти. Бактериалните клетки са малки и прозрачни, което ги прави трудни за идентифициране под обикновен светлинен микроскоп; те трябва да бъдат оцветени. За боядисване на бактерии се използва едно багрило, така че оцветените бактерии образуват ясна цветова разлика от фона, така че тяхната морфология и структура да могат да се наблюдават по-ясно. Този метод е лесен за работа и подходящ за наблюдение на общата форма на бактериалните клетки и разположението на бактериите. Основните багрила обикновено се използват за просто оцветяване. Това е така, защото в неутрални, алкални или слабо киселинни разтвори бактериалните клетки обикновено са отрицателно заредени и когато основните багрила се йонизират, багрилата част от техните молекули е положително заредена, така че те са алкални. Оцветяващата част на багрилото лесно се свързва с бактериите, за да ги оцвети. Оцветените бактериални клетки контрастират рязко с фона, което ги прави по-лесни за идентифициране под микроскоп. Багрилата, които обикновено се използват за просто боядисване, включват метиленово синьо, кристално виолетово, основен фуксин и др. Когато бактериите разграждат захарите и произвеждат киселина, причинявайки спадане на рН на хранителната среда, положителният заряд на бактериите се увеличава. По това време за оцветяване могат да се използват киселинни багрила като еозин, кисел фуксин или конго червено. Бактериите трябва да бъдат фиксирани преди оцветяване. Той има две цели: едната е да убие бактериите и да ги накара да се придържат към предметното стъкло; другото е да се увеличи афинитета им към багрилата. Два често използвани метода са нагряване и химическа фиксация. Когато фиксирате, опитайте се да запазите оригиналната форма на клетките.
3 материала
3.1 Бактерии: Bacillus subtilis 12-18h хранителна агарна наклонена култура, Staphylococcus aureus 24-часова хранителна агарна наклонена култура, Escherichia coli 24-часова хранителна агарна наклонена култура, хлебна мая наклонена агарна култура.
3.2 Оцветител: алкално метиленово синьо багрило на Lu (или кристално виолетово багрило на амониев оксалат), багрило фуксин карболова киселина.
3.3 Инструменти или други прибори: микроскоп, спиртна лампа, предметно стъкло, инокулационна примка, поставка за предметни стъкла, двуслойна бутилка (съдържаща кедрово масло и ксилен), тъкан за лещи, физиологичен разтвор или дестилирана вода и др.
4. Процес: намазка → изсушаване → фиксиране → оцветяване → измиване → изсушаване → микроскопско изследване.
5 стъпки
5.1 Намазка: Вземете две чисти и обезмаслени предметни стъкла. При стерилни условия поставете малка капка физиологичен разтвор (или дестилирана вода) върху всеки център на предметното стъкло. Използвайте примка за инокулация, за да стерилизирате бактериите от Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus и Escherichia coli, вземете малко бактериална морава във водните капчици на наклона, разбъркайте добре и го нанесете на тънък филм. Ако използвате намазка с бактериална суспензия (или течна култура), можете да използвате инокулираща примка, за да изберете 2 до 3 примки и да ги приложите директно върху предметното стъкло. Внимавайте да не капнете твърде много физиологичен разтвор (дестилирана вода) и да премахнете бактериите и да го нанесете равномерно и не много дебело.
5.2 Сушене Сушете естествено на стайна температура. Можете също да го загреете леко над спиртна лампа с покритата страна нагоре, за да изсъхне. Но внимавайте да не се доближавате твърде много до пламъка, тъй като твърде високата температура ще унищожи морфологията на бактериите.
5.3 Фиксиране Ако се използва сушене с топлина, фиксацията и сушенето се комбинират в една стъпка и методът е същият като сушенето. Намажете, подсушете и топлинно фиксирайте.
5.4 Оцветяване: Поставете предметното стъкло плоско върху стойката за предметни стъкла и добавете 1 до 2 капки разтвор на багрилото върху намазката (подходящо е разтворът на багрилото само да покрие филма на намазката). Оцветете с основно метиленово синьо на Лу за 1 до 2 минути и оцветете с карболова киселина фуксин (или амониев оксалат кристално виолетово) за около 1 минута.
5.5 Измиване с вода: Излейте разтвора на багрилото и внимателно изплакнете с чешмяна вода от единия край на предметното стъкло, докато водата, стичаща се от намазката, стане безцветна. Когато измивате с вода, не измивайте покритата повърхност директно с вода. Потокът на водата не трябва да бъде твърде бърз или твърде силен, за да се предотврати падането на петна.
5.6 Сушене: Изтръскайте водните капчици върху предметното стъкло и изсушете естествено, изсушете със сешоар или го попийте с абсорбираща хартия (внимавайте да не изтриете бактериите). 5.7 Микроскопско изследване След като цитонамазката изсъхне, направете микроскопско изследване. Намазката трябва да е напълно суха, преди да се гледа с маслена леща.
6 Резултати Начертайте морфологията на E. coli и Micrococcus luteus, наблюдавани след единично оцветяване.
