Изисквания за подготовка на проби за флуоресцентна микроскопия
Изисквания за подготовка на проба за флуоресцентна микроскопия
(1) Стъклен предмет
Дебелината на предметното стъкло трябва да бъде между 0.8-L2 mm. Предметно стъкло, което е твърде дебело, ще абсорбира повече светлина от една страна и не може да фокусира възбуждащата светлина върху образеца, от друга страна. Предметните стъкла трябва да са гладки, с еднаква дебелина и без видима автофлуоресценция. Понякога се използват кварцови пързалки.
(2) Покривно стъкло
Дебелината на покривното стъкло е около 0,17 мм, гладко. За да се усили възбуждащата светлина, може да се използва и интерферентно покривно стъкло, което е специално покривно стъкло, покрито с няколко слоя вещества (като магнезиев флуорид), които имат различни интерферентни ефекти върху светлина с различни дължини на вълната, което може да направи гладка флуоресценция. Възбуждащата светлина преминава и възбуждащата светлина се отразява и тази отразена възбуждаща светлина може да възбуди образеца.
(3) Образец
Тъканните срезове или други проби не трябва да са твърде дебели. Ако дебелината е твърде голяма, по-голямата част от възбуждащата светлина ще се консумира в долната част на образеца, докато горната част, пряко наблюдавана от лещата на обектива, не може да бъде напълно възбудена. В допълнение, флуоресценцията, причинена от припокриващи се клетки или примеси, фоновото неспецифично оцветяване влияе върху преценката.
(4) масло за огледало
Обикновено, когато се наблюдават проби с флуоресцентни микроскопи с тъмно поле и маслени имерсионни микроскопи, трябва да се използва имерсионно масло. Най-добре е да използвате специално нефлуоресцентно потапящо масло. Вместо това може да се използва и глицерин, както и течен парафин, но коефициентът на пречупване е нисък, което има леко влияние върху качеството на изображението.
Разбиране на светлинния куб на флуоресцентната микроскопия
Флуоресценцията е светлината, при която електроните в дадено вещество абсорбират светлинна енергия от нискоенергийно състояние към високоенергийно състояние и след това освобождават светлина, когато се върнат в нискоенергийно състояние. Това е нетемпературно излъчвана светлина - луминесценция. Тоест: веществото абсорбира късовълнова светлина, влиза във възбудено състояние и излъчва дълговълнова светлина.
Независимо дали става въпрос за автофлуоресценция на веществото, флуоресцентно багрило или флуоресцентен протеин, експресиран чрез сливане, той трябва да бъде възбуден от специфична дължина на вълната на светлината (възбуждане). След като електроните мигрират и загубят енергия, те излъчват светлина със специфична дълга дължина на вълната (излъчване). , които могат да бъдат събрани от системата за откриване, за да се постигне функцията за идентифициране на специфична флуоресценция.
Какво е флуоресцентен светлинен куб?
При наблюдение с флуоресцентен микроскоп и изобразяване възбуждащата светлина със специфична дължина на вълната и съответната емисионна светлина с дълга дължина на вълната се осигуряват от флуоресцентния светлинен куб, така че флуоресцентният сигнал може да бъде събран с невъоръжено око, екран на дисплея или камера. Следователно флуоресцентният светлинен куб определя какво може да бъде открито Ключовото устройство на флуоресцентния сигнал, неговите характеристики включват EX: параметри на филтъра за дължина на вълната на възбуждане, EM: параметри на филтъра за дължина на вълната на излъчване и DM: параметри на дихотомично огледало. Вземете за пример светлинния куб DAPI на интегрирания флуоресцентен микроскоп Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm светлина може да бъде предадена на EM; ЕМ емисионните филтри се използват за отделяне на флуоресценцията, излъчвана от флуорофора, от други фонови оптични елементи за разделяне на светлината. Емисионните филтри предават светлина с дължина на вълната на флуоресценцията през дихроичното огледало, като същевременно блокират цялата друга светлина, която изтича от източника на възбуждаща светлина (отразена от пробата или оптиката). Дължината на вълната на излъчваната светлина е по-голяма от EM, която трябва да се наблюдава, т.е. само светлина в диапазона от 450±25nm влиза в системата за откриване. Правилният избор на EX, EM филтри и DM дихотомии може да помогне на изследователите да постигнат по-високи съотношения сигнал/шум (S/N).
