Принципи на флуоресцентната микроскопия
Флуоресцентните микроскопи се различават от обикновените оптични микроскопи. Вместо да наблюдават образците при осветяване на обикновени източници на светлина, те използват светлина с определена дължина на вълната (обикновено ултравиолетова светлина, синьо-виолетова светлина), за да възбудят флуоресцентните вещества в образците под микроскоп, за да ги накарат да излъчват флуоресценция. Следователно източникът на светлина на флуоресцентния микроскоп не функционира като директно осветление, а като източник на енергия, който възбужда флуоресцентните вещества в образеца. Причината, поради която можем да наблюдаваме образеца, се дължи на осветяването на източника на светлина, но феноменът на флуоресценция, представен след като флуоресцентното вещество в образеца абсорбира възбудената светлинна енергия.
Може да се види, че характеристиката на флуоресцентния микроскоп е, че неговият светлинен източник може да достави голямо количество възбуждаща светлина в определен диапазон на дължина на вълната, така че флуоресцентното вещество в тествания образец да може да получи възбуждаща светлина с необходимия интензитет. В същото време флуоресцентният микроскоп трябва да има съответната филтърна система.
Флуоресцентната микроскопия е важен инструмент в имунофлуоресцентната хистохимия. Състои се от източник на светлина с ултрависоко напрежение, филтърна система (включително филтърна плоча за възбуждане и потискане), оптична система и фотографска система и други основни компоненти. Той използва светлина с определена дължина на вълната, за да възбуди образеца да излъчва флуоресценция.
Начинът за възбуждане на флуоресценция: Според обхвата на дължината на вълната на светлината, той може да бъде разделен на два типа: метод на UV възбуждане (използващ метод на ултравиолетово осветление) и метод на възбуждане на BV (използващ синьо-виолетова светлина). Методът на UV възбуждане използва за възбуждане почти ултравиолетова светлина, по-къса от 400 nm. При този метод няма видима възбуждаща светлина, така че наблюдаваната флуоресценция представя присъщата флуоресценция на багрилото и е лесно да се разграничи специфичната флуоресценция върху образеца от автофлуоресценцията на фоновата тъкан.
Методът на BV възбуждане се основава на 404nm и 434nm за възбуждане от ултравиолетова към синя светлина. Този метод използва синя светлина за облъчване на образеца, така че прекъсващият филтър на системата за наблюдение на флуоресценцията трябва да използва филтър, който може напълно да блокира синята светлина и да пропуска напълно необходимата зелена и жълта флуоресценция. Флуоресцентни багрила за анализи на флуоресцентни антитела. Максималната дължина на вълната на поглъщане на възбуждащата светлина е относително близка до максималната дължина на вълната на излъчване на флуоресценцията, така че филтърът, използван в метода на възбуждане на BV, трябва да използва филтър с рязко прекъсване. Този метод може да използва синя светлина като възбуждаща светлина, така че ефективността на абсорбция на флуоресцентния пигмент е по-висока и може да се получи по-ярко изображение. Недостатъкът му е, че флуоресценцията под 500 nm не може да се види, а флуоресценцията над 500 nm прави цялото изображение жълто. При метода на флуоресцентните антитела специфичността на флуорохрома често се оценява по цвета, уникален за флуорохрома. Следователно, когато се обсъжда фината специфичност, гореспоменатите недостатъци на метода за възбуждане на BV често имат голямо влияние.
За да обобщим, осветяването на флуоресцентния микроскоп може да се разглежда според следните три точки според структурата на кондензатора и дължината на вълната на възбуждащата светлина.
① От гледна точка на изискванията за контраст на флуоресцентното изображение, концентраторът на тъмно поле с UV възбуждане се използва за осветяване.
② Като се има предвид яркостта на изображението, филтърът за възбуждане BV има най-високата ефективност при наблюдение на тъмното поле.
③Характеристиките на наблюдението на тъмно поле с филтър за UV възбуждане и осветяването с концентратор на тъмно поле с възбуждане на BV могат да се разглеждат като между тези два метода на осветяване, но първият има по-силни свойства на тъмното поле и показва по-ярки изображения. Контрастът е малък; последният запазва свойствата на светлинния път на тъмното поле, така че показаното изображение е по-тъмно и контрастът е подобрен. Когато действително се използва флуоресцентен микроскоп, за наблюдение трябва да се използва методът на осветяване, който най-добре отговаря на изискванията на образеца.
Трябва да се отбележи, че дори ако UV-възбуденият кондензатор на тъмно поле с най-добър контраст е осветен, част от ултравиолетовата възбуждаща светлина, пречупена или разпръсната от образеца, ще навлезе в лещата на обектива. Автофлуоресценцията може да влоши реакцията на изображението. Следователно пред окуляра трябва да се използва филтър, абсорбиращ UV лъчите, като филтър за прекъсване.
