Принципи на конфокалната микроскопия
Конфокалният микроскоп е високопрецизен инструмент за изображения, който се появява и развива през 80-те години на миналия век и е основен научен изследователски инструмент за изучаване на субмикронни структури. С развитието на компютрите, софтуера за обработка на изображения и лазерите, конфокалните микроскопи също претърпяха голямо развитие и сега се използват широко в областта на биологията, микросистемите и измерването на материали. Конфокалният микроскоп е нов тип микроскоп, интегриращ конфокален принцип, технология за сканиране и технология за обработка на компютърна графика. Основните му предимства са: висока странична разделителна способност и висока аксиална разделителна способност, както и ефективно потискане на разсеяната светлина с висок контраст.
Типична конфигурация на конфокален микроскоп е да се поставят два малки отвора в конюгираната равнина на фокалната равнина на измервания обект, единият от които е поставен пред източника на светлина, а другият е поставен пред детектора, както е показано на фигура 1. Може да се види от фигурата, че когато измерената проба е в квазифокусната равнина, интензитетът на светлината, събран от края на детекцията, е най-голям; когато измерената проба е в позиция извън фокус, светлинното петно в края на детекцията се разсейва и интензитетът на светлината намалява бързо. Следователно само светлината, излъчвана от точки на фокалната равнина, може да премине през изходния отвор, докато светлината, излъчвана от точки извън фокалната равнина, е дефокусирана върху равнината на изходния отвор и повечето от тях не могат да преминат през централния отвор. Поради това целевата точка за наблюдение във фокалната равнина изглежда ярка, а точката, която не се наблюдава, изглежда черна като фон, увеличавайки контраста и изчиствайки изображението. По време на процеса на изобразяване двете дупки са конфокални, конфокалната точка е откритата точка, а равнината, където се намира откритата точка, е конфокалната равнина.
Размерът на дупката на детектора при конфокална микроскопия играе критична роля. Той пряко влияе върху разделителната способност и съотношението сигнал/шум на системата. Ако дупката е твърде голяма, ефектът на конфокално откриване няма да бъде постигнат, което не само намалява разделителната способност на системата, но също така въвежда повече разсеяна светлина; ако дупката е твърде малка, това ще намали ефективността на откриване и ще намали микроскопичното изображение. яркост. Проучванията показват, че когато диаметърът на отвора е равен на диаметъра на диска Airy, конфокалните изисквания са изпълнени и ефективността на откриване не се намалява значително. Тъй като диаметърът на отвора обикновено е от порядъка на микрони, ако има отклонение между фокусната точка на лазерния лъч и позицията на отвора, ще възникне изкривяване на сигнала. Следователно конфокалните микроскопи обикновено използват система за автоматично фокусиране, което на практика увеличава времето за измерване.
Тъй като лазерният конфокален сканиращ микроскоп е точково изображение, за да се получи двуизмерно изображение на обекта, е необходимо да се използва двуизмерно сканиране в посоките x и y. Различните микроскопи използват различни методи за сканиране:
(1) Сканиране на обекти. Тоест, самият обект се движи по определен закон, докато светлинният лъч остава непроменен. Предимства: стабилен оптичен път; Недостатъци: необходима е голяма маса за сканиране, така че скоростта на сканиране е силно ограничена.
(2) С помощта на отразяващ галванометър се формира система за сканиране на лъча. Тоест, чрез контролиране на сканиращия галванометър, фокусираното светлинно петно редовно се отразява към определен слой на обекта, за да завърши двуизмерното сканиране. Предимството му е, че има висока точност и често се използва за измерване с висока точност. Скоростта на сканиране се подобри спрямо сканирането на обекти, но все още не е бърза.
(3) Използвайте акустооптичния отклоняващ елемент за сканиране и сканирането се осъществява чрез промяна на изходната честота на звуковата вълна и след това промяна на посоката на предаване на светлинната вълна. Неговото изключително предимство е, че скоростта на сканиране е много висока. Системата за сканиране, разработена от Съединените щати, използва акустооптичен дефлектор за генериране на видео изображения в реално време. Отнема само 1/30s за сканиране на двуизмерно изображение и почти постига изход в реално време.
(4) Сканиране на диск по Nipkow. Процесът на сканиране завършва чрез завъртане на диска Nipkow, докато другите компоненти остават неподвижни. Може да се изобрази наведнъж и скоростта е много бърза. Въпреки това, тъй като изобразяващият лъч е извъносева светлина, извъносовата аберация на лещата трябва да бъде коригирана и степента на използване на светлинната енергия е много ниска.
