Принцип и конструкция на флуоресцентния микроскоп
Флуоресцентният микроскоп използва точков светлинен източник с висока светлинна ефективност, който излъчва светлина с определена дължина на вълната (като ултравиолетова светлина 3650 in или виолетова синя светлина 4200 in) чрез система за цветно филтриране като възбуждаща светлина и възбужда флуоресцентните вещества в пробата до излъчват различни цветове флуоресценция. След това се наблюдава чрез увеличение на обектива и окуляра. По този начин, дори при слаба флуоресценция, той е лесно разпознаваем и силно чувствителен при силен контрастен фон, използван главно за изследване на клетъчна структура и функция, както и химически състав. Основната структура на флуоресцентния микроскоп се състои от обикновен оптичен микроскоп и някои аксесоари (като източник на флуоресцентна светлина, възбуждащ филтър, бихроматичен разделител на лъча и блокиращ филтър и др.). Флуоресцентни източници на светлина - обикновено използват живачни лампи със свръхвисоко налягане (50-200W), които могат да излъчват светлина с различни дължини на вълната. Всяко флуоресцентно вещество обаче има дължина на вълната на възбуждащата светлина, която произвежда най-силната флуоресценция, така че трябва да се добавят възбуждащи филтри (обикновено ултравиолетови, лилави, сини и зелени възбуждащи филтри), за да се позволи само определена дължина на вълната на възбуждащата светлина да премине през и освети образеца, докато абсорбира цялата останала светлина. След като бъде облъчено от възбудена светлина, всяко вещество излъчва видима флуоресценция с по-голяма дължина на вълната от облъчването за много кратък период от време. Флуоресценцията има специфичност и обикновено е по-слаба от възбуждащата светлина. За да се наблюдава специфична флуоресценция, трябва да се добави блокиращ (или потискащ) филтър зад лещата на обектива. Той има две функции: първо, той абсорбира и блокира навлизането на възбуждаща светлина в окуляра, за да избегне нарушаване на флуоресценцията и увреждане на очите; второ, той избира и позволява специфична флуоресценция да премине, показвайки специфичен флуоресцентен цвят. И двата вида филтри трябва да бъдат избрани за използване заедно.
Има два вида флуоресцентни микроскопи въз основа на техния оптичен път:
1. Трансмисионен флуоресцентен микроскоп: Източникът на възбуждаща светлина се предава през материала на пробата през кондензатор за възбуждане на флуоресценция. Често използвани светлинни колектори за тъмно поле или обикновени светлинни колектори могат да се използват за регулиране на рефлектора за преобразуване на възбуждаща светлина и странична светлина върху образеца. Това е сравнително старомоден флуоресцентен микроскоп. Предимството му е, че флуоресценцията е силна при ниско увеличение, докато недостатъкът му е, че флуоресценцията отслабва с увеличаване на увеличението. Поради това е по-добре да се наблюдават материали с по-големи проби.
2. Флуоресцентен микроскоп с падащ лъч Това е нов тип флуоресцентен микроскоп, разработен в съвремието. За разлика от предишния, възбуждащата светлина пада от лещата на обектива към повърхността на образеца, като се използва същата леща на обектива като осветителния кондензатор и лещата на обектива за събиране на флуоресценция. Трябва да се добави двуцветен разделител на лъча към оптичния път, който е под ъгъл от 45 градуса спрямо лекия уран. Възбуждащата светлина се отразява в лещата на обектива и се концентрира върху пробата. Флуоресценцията, генерирана от пробата, както и възбуждащата светлина, отразена от повърхността на лещата на обектива и покриващото стъкло, навлизат в лещата на обектива едновременно и се връщат в разделителя на дихроичния лъч, разделяйки възбуждането и флуоресценцията. След това остатъчното възбуждане се абсорбира от блокиращия филтър. Ако се използват различни комбинации от възбуждащи филтри/двуцветни сепаратори на лъчи/блокиращи филтри, те могат да отговорят на нуждите на различни флуоресцентни реакционни продукти. Предимството на този флуоресцентен микроскоп е, че осветяването на зрителното поле е равномерно, изображението е ясно и колкото по-голямо е увеличението, толкова по-силна е флуоресценцията.
