Многофотонна микроскопска технология за изобразяване: поляризационна-разрешена втора-хармонична микроскопия и нейната обработка на изображения
В нелинейните оптични микроскопи обикновено се използва изобразяване на второ хармонично поколение (SHG) за наблюдение на ендогенни влакнести структури и интензитетът на SHG до голяма степен зависи от относителния ъгъл между посоката на поляризация на падащия лъч и оста на ориентация на целевата молекула. Следователно поляризационно базирано SHG изображение (P-SHG) може да получи структурна информация за целевите молекули чрез анализиране на функционалната връзка между интензитета на SHG сигнала и поляризационното състояние на падащия лъч. Сега се използва като важен инструмент за медицински и биологични анализи.
Прости SHG изображения могат да бъдат получени чрез традиционна дву-флуоресцентна микроскопия с възбуждане на фотони (TPM). Повечето TPM системи все още използват метод за сканиране с един лъч, базиран на движещо се огледало, чиято времева разделителна способност зависи от физическата скорост на движение на огледалото. За да се постигне по-бързо изобразяване, системата TPM може също да приеме метод за многолъчево сканиране (Фигура 1A), единият от които е да използва сканиращ модул с въртящ се диск. Този модул се състои от въртяща се поставка с коаксиални микрообективи и въртяща се поставка с микрообективи, като микролещите и отворите на всяка въртяща се поставка съответстват едно-към-едно.
Когато лазерът преминава през въртящата се поставка за микролещи, фронтът на вълната покрива множество микролещи. Различните микролещи фокусират различни части от фронта на вълната в различни позиции и преминават през съответните дупки, образувайки множество микро лъчи. Тези микро лъчи, удрящи пробата, могат едновременно да възбудят множество сигнали. Тези сигнали се връщат по протежение на системата на микроскопа и отново преминават през дупката и накрая се отразяват от дихроичното огледало между двете грамофони в устройството за откриване. Обаче често използваният титаниев сапфирен лазер със заключен режим- като светлинен източник има недостатъчна енергия, което ограничава броя на възбуждащите лъчи и води до малко ефективно зрително поле (FOV) за TPM (TPM-SD) при използване на въртящ се сканиращ модул.
Ай Гото и др. насочени към постигане на високо{1}}скоростно P-SHG изображение с голямо зрително поле (FOV) с помощта на TPM-SD система. Поради това лазерен източник на базата на Yb с по-висока пикова мощност беше въведен в системата TPM-SD.
Това е схематична диаграма на разработената от тях TPM-SD система. Източникът на светлина на системата е базиран на Yb лазер, който генерира фемтосекундни импулси с централна дължина на вълната 1042 nm, средна мощност 4 W, ширина на импулса 300 fs и честота на повторение 10 MHz. Системата първо регулира мощността на лазера чрез полувълнова плоча и лазерен поляризатор Glan и след това разширява лъча чрез разширител на лъча. Разширеният лъч се въвежда в модула за сканиране на въртяща се маса и множество микро лъчи, излизащи от модула за сканиране, се фокусират върху множество точки от пробата чрез леща на обектив с потапяне във вода. За да се регулира състоянието на поляризация на светлинния лъч в лещата на обектива, върху оптичния път на възбуждащия лъч се поставят полувълнова плоча и четвърт вълнова плоча.
