Мултифотонна микроскопия: разнообразни техники за изобразяване на неврони in vivo
В сравнение с традиционния еднофотонен флуоресцентен микроскоп с широко поле, многофотонната микроскопия (MPM) има функциите на оптично разделяне и дълбоко изобразяване. През 2019 г. Jerome Lecoq и др. обсъдиха свързаната MPM технология от три аспекта: невронно изображение дълбоко в мозъка, масивно невронно изображение и високоскоростно невронно изображение.
За да се свърже активността на невроните със сложното поведение, обикновено е необходимо да се изобразят неврони в дълбоката кора, което изисква MPM да има способността за дълбоко изобразяване. Възбуждащата и емисионната светлина ще бъде силно разпръсната и абсорбирана от биологичната тъкан, което е основният фактор, ограничаващ дълбочината на изображението на MPM. Въпреки че проблемът с разсейването може да бъде решен чрез увеличаване на интензитета на лазера, той ще доведе до други проблеми, като изгаряне на пробата, дефокусиране и флуоресцентно възбуждане в близост до повърхността. Най-добрият начин за увеличаване на дълбочината на MPM изображения е да се използват по-дълги дължини на вълните като възбуждаща светлина.
В допълнение, за двуфотонно (2P) изображение, извън фокуса и възбуждането на флуоресценция близо до повърхността са двата най-големи фактора, ограничаващи дълбочината, докато за трифотонно (3P) изображение тези два проблема са значително намалени, но трифотонно изображение, дължащо се на флуоресценция Напречното сечение на абсорбция на групата е много по-малко от това на 2P, така че е необходим порядък по-висока импулсна енергия, за да се получи флуоресцентен сигнал със същия интензитет като този, възбуден от 2P. Функционалната 3P микроскопия е по-взискателна от структурната 3P микроскопия, която изисква по-бързо сканиране, за да се вземе проба от невронната активност навреме; необходима е по-висока импулсна енергия, за да се съберат достатъчно сигнали в рамките на времето на задържане на всеки пиксел.
Сложното поведение често включва големи мозъчни мрежи с локални и далечни връзки. За да се свърже активността на невроните с поведението, е необходимо да се наблюдава активността на много големи и широко разпространени неврони едновременно. Невронната мрежа в мозъка обработва входящите стимули в рамките на десетки милисекунди. За да се разбере тази бърза невронна мрежа. За да се изследва динамиката на невроните, MPM трябва да има способността да изобразява бързо неврони. Бързите MPM методи могат да бъдат разделени на техники за еднолъчево сканиране и техники за многолъчево сканиране.
Технологията за сканиране с един лъч позволява високоскоростно обхождане на нервната тъкан с голямо зрително поле (FOV)
Когато използвате MPM за изобразяване на неврони, сканирането с произволен достъп - т.е. лазерният лъч се сканира бързо във всяка избрана точка от цялото зрително поле - може да сканира само невроните, които представляват интерес, което не само избягва сканирането на всякакви небелязани нервни влакна, може и също оптимизира времето за сканиране на лазерния лъч. Сканиране с произволен достъп (фиг. 1) може да се постигне с акустооптичен дефлектор (AOD), който работи чрез свързване на пиезоелектричен преобразувател с радиочестотен сигнал към подходящ кристал. Получените акустични вълни предизвикват решетка с периодичен индекс на пречупване. Дифракция възниква, когато лазерен лъч преминава през решетка. Интензитетът и честотата на звуковата вълна могат да се регулират от радиочестотния електрически сигнал, за да се промени интензитетът и посоката на дифрактирана светлина, така че едномерно хоризонтално произволно точково сканиране да може да се реализира с помощта на един AOD и 3D може да се реализира чрез използване на двойка AOD, комбинирани с други технологии за аксиално сканиране, сканиране с произволен достъп. Тази техника обаче е много чувствителна към движението на пробата и е склонна към артефакти при движение. Понастоящем бързото растерно сканиране, тоест прогресивното сканиране в FOV, се използва широко, тъй като алгоритъмът може лесно да разреши артефактите на движението.
Базирано на AOD двуфотонно изобразяване на неокортикални L2/3 неврони in vivo [2]
Има много начини за реализиране на бързо растерно сканиране, като се използва вибриращо огледало за бързо 2D сканиране, комбиниране на вибриращо огледало и регулируема електрическа леща за бързо 3D сканиране, но регулируемата електрическа леща не може бързо да фокусира в аксиална посока поради ограничението на Механично инерционно превключване, което влияе на скоростта на изобразяване, вече може да бъде заменено с модулатор на пространствена светлина (SLM).
Дистанционното фокусиране също е средство за постигане на 3D изображения, както е показано на фигура 2. В модула LSU сканиращият галванометър сканира хоризонтално, а модулът ASU включва лещата на обектива L1 и огледалото M, а аксиалното сканиране се осъществява чрез регулиране позицията на М. Тази техника може не само да коригира оптичната аберация, въведена от лещата на главния обектив L2, но и да позволи бързо аксиално сканиране. За да се получи повече невронно изображение, FOV може да се увеличи чрез коригиране на дизайна на лещата на обектива на микроскопа, но лещата на обектива с голям NA и голям FOV обикновено е тежка и не може да се движи бързо за бързо аксиално сканиране, така че големите FOV системи разчитат на Telefocus , SLM и регулируеми моторизирани лещи.
Схематична диаграма на двуфотонна система за изображения с дистанционно фокусиране [3] Технологията за многолъчево сканиране може едновременно да изобразява различни позиции на невронна тъкан
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm разстояние) места за изображения (фиг. 3C,D); за съседни региони обикновено се използват множество лъчи от единична леща на обектив за изобразяване (фиг. 3E, F). Техниката на многолъчево сканиране трябва да обърне специално внимание на проблема с пресичането между възбуждащите лъчи, който може да бъде решен чрез метода за разделяне на светлинния източник или метода на пространствено-времево мултиплексиране. Методът за разделяне на източника на светлина post-hoc се отнася до използването на алгоритми за разделяне на лъчите за елиминиране на кръстосани смущения; методът на време-пространствено мултиплексиране се отнася до едновременното използване на множество възбуждащи лъчи, импулсите на всеки лъч се забавят във времето, така че отделните лъчи, възбудени от различни лъчи, могат временно да бъдат разделени. флуоресцентен сигнал. Повече неврони могат да бъдат изобразени чрез въвеждане на повече лъчи, но множество лъчи ще увеличат припокриването на времето на затихване на флуоресценцията, което ограничава способността за разграничаване на източниците на сигнал; и мултиплексирането има отрицателно въздействие върху скоростта на работа на електронните устройства. Високи изисквания; голям брой лъчи също изискват по-висока лазерна мощност за поддържане на приблизително съотношение сигнал/шум на един лъч, което лесно може да доведе до увреждане на тъканите.
Технология за изображения с голяма площ
През последните години развитието на различни MPM технологии разшири обхвата на нашето изобразяване на нервна тъкан, което ни позволява да изобразяваме повече неврони дълбоко в мозъка с по-бърза скорост, което значително насърчи невронаучните изследвания и ни даде възможност да придобием по-ясно разбиране на мозъчната функция.
