Класна стая за микроскопски изображения丨Приложение на флуоресцентна микроскопия
Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRFM) е техника, която използва мимолетната вълна, генерирана от светлинен лъч, разпространяващ се между две среди с различен индекс на пречупване, за да изследва повърхността на флуоресцентно белязани живи клетки. На практика, когато падащ лазерен лъч срещне границата между покривното стъкло и водната среда, съдържаща клетките, той се отразява под критичния ъгъл (пълно вътрешно отражение). Тъй като енергията на мимолетната вълна намалява експоненциално с разстоянието от покривното стъкло, само флуорофорите в рамките на 10 нанометра от повърхността (между 10 и 200 нанометра) се възбуждат от мимолетната вълна, докато флуорофорите по-далеч са до голяма степен невъзбудени. Засегнати. По този начин TIRFM води до високи нива на сигнала от флуорофори, разположени близо до покривното стъкло, насложени върху много тъмен фон, осигурявайки отлично съотношение сигнал/шум. Изключителното ограничение на дълбочината на възбуждане е идеално за изследване на единични молекули или състав на мембрана и органели в прилепнали клетки близо до повърхността на покривното стъкло (вижте Фигура 8(e)). Тъй като възбуждането е ограничено до тънки региони близо до покривното стъкло, фотоизбелването и фототоксичността също са ограничени до тези региони, което прави TIRFM един от най-полезните методи за дългосрочно наблюдение. Техниката се превърна в основен инструмент за изучаване на широк спектър от явления в клетъчната и молекулярната биология.
Деконволюцията е алгоритъм, приложен към набор от изображения с пълен фокус, получени по протежение на оптичната (Z) ос, за подобряване на фотонния сигнал в купчина изображения за дадена равнина на изображението или множество фокални равнини. Микроскопите трябва да бъдат оборудвани с високопрецизни моторизирани задвижвания за фокусиране, за да се гарантира получаването на изображение на точно определени интервали между фокалните равнини на пробата. В типично приложение (вижте Фиг. 8(f)), процесът на деконволюция се използва за премахване на замъгляване и премахване на нефокусирана светлина от дадена фокална равнина, като се използва възбуждане и излъчване на флуоресценция с широко поле. Най-сложното приложение е да се приложи процесът на деконволюция към целия стек от изображения, за да се генерират прожектирани изгледи или 3D модели. Набор от изображения с широко поле, използвани за деконволюция, улавя теоретичния максимален брой фотони, излъчени от пробата. Процесът на деконволюция преразпределя "замъглените" интензитети на фотони, излъчвани над и под фокалната равнина, обратно към оригиналната равнина. По този начин деконволюцията използва почти всички налични интензитети на излъчване и осигурява оптимален светлинен бюджет, което прави тази техника предпочитан метод за много чувствителни към светлина проби.
Вариант на феномена на резонансен енергиен трансфер при флуоресцентна микроскопия, флуоресценция или резонансен енергиен трансфер на Förster (FRET) се използва за получаване на количествена времева и пространствена информация за свързването и взаимодействието на протеини, липиди, ензими и нуклеинови киселини в живи клетки. FRET може да използва или техники с постоянно състояние, или техники с разрешаване във времето, но FRET изображенията с разрешение във времето имат предимството да картографират по-точно разстоянията донор-акцептор. Стандартен широкополов флуоресцентен микроскоп, оборудван с подходящи филтри за възбуждане и излъчване и чувствителна камера, може да се използва за FRET изображения. Биосензори, които поставят чувствителен към околната среда протеин или пептид между два флуоресцентни протеина, приложими за FRET, в момента се използват широко в клетъчната биология. Тези сонди лесно се изобразяват под флуоресцентна микроскопия с широко поле, като се използват чувствителни емисионни FRET техники, комбинирани със съотношителен анализ. В допълнение, спектралното изобразяване и линейното размесване с помощта на лазерно сканираща конфокална микроскопия може да помогне за наблюдение на FRET явления в биосензори и други приложения на флуоресцентни протеини.
Микроскопията за изобразяване на флуоресцентен живот (FLIM) е усъвършенствана техника, способна едновременно да записва продължителността на флуоресценцията и пространственото местоположение на флуорофор на всяко място в изображението. Този метод осигурява механизъм за изследване на параметри на околната среда като pH, йонна концентрация, полярност на разтворителя, нековалентни взаимодействия, вискозитет и кислородно напрежение в единични живи клетки и представя данните в пространствени и времеви масиви. Измерванията на FLIM на живота на възбудено състояние в наносекундна скала са независими от локалните концентрации на флуорофор, ефектите на фотоизбелване и дължината на пътя (дебелина на пробата), но са чувствителни към реакции на възбудено състояние, като резонансен трансфер на енергия. Всъщност, комбинирането на FLIM с FRET чрез наблюдение на промените в живота на флуоресцентни донори преди и след трансфер на резонансна енергия се счита за един от най-добрите начини за изследване на това явление.
Подвижността (коефициент на напречна дифузия) на флуоресцентно белязани макромолекули и малки флуорофори може да се определи чрез техника за възстановяване на флуоресценцията след фотоизбелване (FRAP). При FRAP много малка избрана област (няколко микрометра в диаметър) се осветява интензивно, обикновено с лазер, за да се получи пълно фотоизбелване на флуорофора в тази област. Резултатът е драматично намаляване или унищожаване на флуоресценцията. След импулс на фотоизбелване, скоростта и степента на възстановяване на интензитета на флуоресценция в избелените области се наблюдават като функция на времето при ниски интензитети на възбуждане, за да се генерира информация за кинетиката на репопулацията и възстановяването на флуорофора (Фигура 9). FRAP обикновено се извършва с помощта на EGFP или други флуоресцентни протеини. Свързаните техники за фотоактивиране се основават на специални синтетични флуорофори в клетки или подобни функционални флуоресцентни протеини, които могат да бъдат активирани чрез къси импулси на UV или виолетово. Фотоактивирането и FRAP могат да се използват като допълнителни техники за определяне на параметрите на мобилност.
В техника, свързана с FRAP, наречена загуба на флуоресценция след фотоизбелване (FLIP), определена флуоресцентна област в жива клетка претърпява многократно фотоизбелване чрез интензивно облъчване. Ако всички флуорофори успеят да дифундират в зоната, която се фотоизбелва по време на измерения период, това ще доведе до пълна загуба на флуоресцентен сигнал в цялата клетка. Чрез изчисляване на скоростта, с която флуоресценцията изчезва от цялата клетка, може да се определи дифузионната подвижност на целевия флуорофор. В допълнение, FLIP може лесно да идентифицира местоположението и естеството на всякакви дифузионни бариери между отделните отделения на клетките, като например бариерата между сомата и аксона на неврон.
Флуоресцентната корелационна спектроскопия (FCS), използвана главно в лазерна сканираща конфокална микроскопия или многофотонна микроскопия, е метод, предназначен за определяне на кинетична информация като скорости на химична реакция, коефициенти на дифузия, техники за молекулно тегло, скорост на потока и агрегация. При FCS малък обем (приблизително един фемтометър; дифракционно-ограниченият фокус на лазера) се осветява с фокусиран лазерен лъч, за да се запишат флуктуациите на интензитета на автофлуоресценцията, предизвикани от динамиката на флуоресцентните молекули като функция на времето в обема, зает от флуоресцентния молекули (фиг. 10). Сравнително малки флуорофори дифундират бързо в осветения обем, произвеждайки кратки изблици с произволен интензитет. Обратно, по-големите комплекси (флуорофори, свързани с макромолекули) се движат по-бавно, произвеждайки по-дълги, по-устойчиви модели на интензитет на флуоресценция, зависими от времето.
Когато флуоресцентно белязаните структури са плътно опаковани и се припокриват в специфични региони на живи клетки, тяхната динамика и пространствено разпределение са трудни за анализиране. Флуоресцентната точкова микроскопия (FSM) е техника, съвместима с почти всички модалности за изобразяване, която се възползва от много ниски концентрации на флуоресцентно маркирани субединици, намалява флуоресценцията извън фокуса и подобрява видимостта на белязаните структури и тяхната динамика в дебели области. FSM се изпълняват чрез етикетиране само на част от цялата представляваща интерес структура. В този смисъл FSM е подобен на извършването на FCS върху цялото зрително поле, въпреки че поставя повече акцент върху пространствените модели, отколкото върху количествения времеви анализ. Флуоресцентната точкова микроскопия е особено полезна при определяне на мобилността и агрегацията на цитоскелетни елементи като актин и микротубули в хиперактивни клетки.
Микроскопията с изчерпване на стимулираните емисии (STED) е нововъзникваща техника със супер разделителна способност с пространствена разделителна способност далеч отвъд границата на дифракция, използваща пръстеновидна изчерпана светлина, за да заобиколи по-малък лъч от възбуждаща светлина, за да се получи под-50 nm по оста на резолюцията. Техниката разчита на възбуждане на флуорофори със синхронизирани лазерни импулси и пространствено координирани кръгови STED импулси, които изчерпват излъчената светлина, потискайки флуоресценцията на възбудени молекули около фокуса на лазерно сканиране. Флуоресценцията, генерирана в периферията на петното, се потиска, но не и в центъра на петното, като по този начин значително се намалява размерът на флуоресцентното петно и съответно значително се увеличава разделителната способност. STED се оказа полезен инструмент за откриване на живи клетки с висока разделителна способност. Други нововъзникващи техники със супер разделителна способност, като фотоактивирана микроскопия за локализация (PALM) и микроскопия със структурирана светлина (SIM), също ще станат основни инструменти за изображения на живи клетки в близко бъдеще.
Нарастващото използване на генетично кодирани флуоресцентни протеини и усъвършенствани синтетични флуорофори за изображения на живи клетки отваря вратата към нови оптични модалности за наблюдение на времевата динамика и пространствените взаимоотношения. Микроскопистите вече разполагат с пълен набор от инструменти за наблюдение и запис на данни за изображения на клетъчни процеси, протичащи в широк диапазон от времеви мащаби и с множество разделителни способности. По-бавните събития могат лесно да бъдат наблюдавани и записани с помощта на лазерна сканираща конфокална микроскопия, докато по-бързите кинетични събития могат да бъдат получени с помощта на технологията на въртящ се диск. В допълнение, многофотонната микроскопия позволява дълбоко изобразяване в дебели тъкани, а техниките за пълно вътрешно отражение позволяват сондиране на мембранни повърхности с конфокална прецизност. Усъвършенствани флуоресцентни методи, като FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM и STED, могат да се използват за наблюдение на взаимодействията протеин-протеин при разделителни способности, често по-добри от разрешените от границата на дифракция. С напредъка във флуорофорната, микроскопската и детекторната технология един по-широк свят ще бъде поставен "под микроскопа".
