Евтин дизайн на флуоресцентен и светло полеви микроскоп
Флуоресцентната микроскопия е метод, използван за визуализиране на
В това ръководство ще прегледам основите на флуоресцентната микроскопия и как да изградя три различни евтини флуоресцентни микроскопа. Тези системи обикновено струват хиляди долари, но наскоро бяха положени някои усилия да бъдат направени по-достъпни. Дизайните, които представям тук, използват смартфон, dSLR и USB микроскоп. Всички тези дизайни могат да се използват и като микроскопи със светло поле.
Стъпка 1: Преглед на флуоресцентната микроскопия
За да разберете основните концепции на флуоресцентната микроскопия, представете си гъста гора през нощта с дървета, животни, храсти и други живи гори. Ако насочите факла към гората, ще видите всички тези структури и ще ви е трудно да визуализирате конкретни животни или растения. Да предположим, че се интересувате само от боровинкови храсти в гората. За да направите това, обучавате светулката да бъде привлечена само от боровинкови храсти, така че когато погледнете гората, само боровинковите храсти да светят. Може да се каже, че използвате светулки, за да маркирате боровинкови храсти, така че да можете да видите боровинкови структури в гората.
В тази аналогия гората представлява цялата проба, боровинковите храсти представляват структурите, които искате да визуализирате (напр. специфични клетки или субклетъчни органели), а светулките са флуоресцентни съединения. Осветяването само на факела без светулки е подобно на микроскопия в светло поле.
Следващата стъпка е да се разбере основната функция на флуоресцентните съединения (известни също като флуорофори). Флуорофорите всъщност са малки обекти (наномащаб), предназначени да свързват специфични структури в проба. Те абсорбират тесен диапазон от дължини на вълната на светлината и повторно излъчват светлина с друга дължина на вълната. Например, флуорофорът може да абсорбира синя светлина (т.е. флуорофорът се възбужда от синя светлина) и след това отново да излъчи зелена светлина. Това обикновено се обобщава от спектрите на възбуждане и излъчване (по-горе). Тези диаграми показват дължината на вълната на светлината, абсорбирана от флуорофора, и дължината на вълната на светлината, излъчвана от флуорофора.
Дизайнът на микроскопа е много подобен на този на нормален микроскоп със светло поле, с две основни разлики. Първо, светлината, осветяваща пробата, трябва да бъде с дължината на вълната, която възбужда флуорофора (за горния пример светлината е синя). Второ, микроскопът трябва само да събере излъчената светлина (зелена светлина), докато блокира синята светлина. Това е така, защото синята светлина е навсякъде, но зелената идва само от специфични структури в пробата. За да блокират синята светлина, микроскопите обикновено имат нещо, наречено дългопропускащ филтър, който пропуска зелената светлина без синя светлина. Всеки дългопропускащ филтър има дължина на вълната на прекъсване. Ако светлината има дължина на вълната, по-голяма от дължината на вълната на прекъсване, тя може да премине през филтъра. Оттук и името "дълъг пас". По-късите дължини на вълните са блокирани.
Стъпка 2: Моделиране на микроскопа с оптична оптика
Това е допълнителна стъпка към основните принципи на дизайна на микроскопа. Няма нужда да създавате флуоресцентен микроскоп, така че можете да го пропуснете, ако не искате да се задълбочавате в оптиката.
Както светлите, така и флуоресцентните микроскопи могат да бъдат моделирани с помощта на лъчева оптика. Основната предпоставка на лъчевата оптика е, че светлината се държи подобно на светлината, която се отдалечава от светлинен източник. Когато се огледате в стаята, виждате светлина от слънчева светлина извън прозорец или от електрическа крушка. След това светлината се абсорбира или отразява от предметите в стаята. Част от отразената светлина я кара да бъде насочена към очите ви. Ако обектът е осветен, можете да си представите всяка точка от обекта, излъчваща светлина във всички посоки (по-горе). Лещата, подобно на лещата в очите ни, фокусира светлината до точка, за да можем да видим обекта. Без леща светлината продължава да се движи навън и не образува изображение.
И така, как да направим оптични системи, които увеличават малки обекти? За да разберете дизайна, наистина трябва да знаете само две уравнения: уравненията за изобразяване на тънка леща и уравнения за увеличение:
1/f=1/si + 1/so
M=-si/so
f е фокусното разстояние на лещата. По-късото фокусно разстояние означава, че обективът има по-голяма сила на фокусиране.
Същото важи и за разстоянието на обекта; разстоянието между лещата и обекта (например дърво).
si е разстоянието на изображението; разстоянието между лещата и мястото, където се формира изображението
M е увеличение; колко голямо е изображението спрямо обекта. За микроскопите искаме да увеличим увеличението.
За пълен урок относно уравнението на тънката леща вижте това видео на Khan Academia. В gif-а по-горе можете да видите, че разстоянието, на което обектът се приближава до обектива, увеличава разстоянието на изображението, което увеличава увеличението. Вертикалната линия с две стрелки показва лещата.
