Подобрени предимства на многофотонната микроскопия с лазерно сканиране
Лазерният сканиращ многофотонен микроскоп е голямо подобрение в оптичната микроскопия, главно във възможността да се наблюдава дълбоката структура на живи и фиксирани клетки и тъкани и да се получат ясни и остри многослойни Z-равнинни структури, т.е. оптични срезове, от които може да се изгради триизмерна плътна структура на образеца. Конфокалната микроскопия използва източник на лазерна светлина, който се разширява, за да запълни цялата задна фокална равнина на лещата на обектива, и след това преминава през системата от лещи на лещата на обектива, за да се слее в много малки петна във фокалната равнина на образеца. В зависимост от цифровата апертура на лещата на обектива, размерът на диаметъра на точката на ярко осветяване е около 0.25 ~ 0.8 μm, а дълбочината е около 0.5 ~ 1.5 μm. Размерът на конфокалната точка се определя от дизайна на микроскопа, дължината на вълната на лазера, характеристиките на лещата на обектива, настройката на състоянието на сканиращия модул и естеството на образеца. Полевите микроскопи имат голям диапазон на осветяване и дълбочина на осветяване, докато конфокалните микроскопи концентрират осветяването в една фокусна точка на фокалната равнина. Най-основното предимство на конфокалния микроскоп е способността да се правят фини оптични срезове на дебели флуоресцентни образци (до 50 μm или повече), с дебелина на срезовете от около 0,5 до 1,5 μm. Могат да бъдат получени поредица от изображения на оптичен разрез чрез преместване на образеца нагоре и надолу със стъпковия двигател на Z-ос на микроскопа. Получаването на информация за изображението се контролира в първата равнина и не се намесва от сигнали, излъчвани от други места на образеца. След премахване на ефектите от фоновата флуоресценция и увеличаване на съотношението сигнал/шум, контрастът и разделителната способност на конфокалното изображение са значително подобрени в сравнение с конвенционалните флуоресцентни изображения, осветени в полето. В много екземпляри много сложни структурни компоненти се преплитат, за да образуват сложни системи, но след като могат да бъдат придобити достатъчно оптични секции, можем да ги реконструираме в три измерения с помощта на софтуер. Този експериментален метод е широко използван в биологичните изследвания за изясняване на сложните структурни и функционални връзки между клетките или тъканите.
