Колко знаете за флуоресцентната микроскопия
Флуоресцентните микроскопи обикновено използват живачни лампи с висок интензитет като източници на възбуждаща светлина. Филтрите се използват за филтриране на нежелана светлина, оставяйки само чистата светлина с висок интензитет, която възбужда флуорофора. След като монохроматичната светлина облъчи пробата през лещата на обектива, пробата ще бъде възбудена да излъчва светлина (флуоресценция) и както флуоресценцията, така и възбуждащата светлина ще се върнат по оптичния път на лещата на обектива. В този случай е необходимо дихроично огледало за филтриране на възбуждащата светлина. , оставяйки само флуоресценцията, от която се нуждаем, да видим.
Тази флуоресценция достига до окуляра по светлинния път на микроскопа и след това навлиза в очите ни, където можем да видим флуоресценцията, излъчвана от флуорофора.
Предварителна проверка и настройка на флуоресцентния микроскоп:
(1) Преди всяко наблюдение на флуоресценцията е необходимо рутинно да се проверяват подравняването на нажежаемата нишка, фокуса на оптичния път, апертурната диафрагма и настройките на полевата диафрагма на флуоресцентното устройство.
(2) Дали необходимият филтър за възбуждане/емисия на флуоресценция е инсталиран в преобразувателя, дали обективът на флуоресцентния микроскоп е правилно конфигуриран и отстранете маслените петна и праха върху предната леща на обектива.
(3) Ако едновременно се извършва наблюдение на фазовия контраст на пропуснатата светлина, е необходимо да се провери конюгирането на центъра на кондензатора и пръстена на фазовия контраст срещу лещата на обектива.
(4) Проверете дали носителят на пробата (предметно стъкло, покривно стъкло и други прибори) е покрит с течност или прах и дали дебелината е в рамките на калибрирания диапазон на работно разстояние на лещата на обектива. Нарязаната проба не трябва да е твърде дебела, за предпочитане по-малка или равна на 10 μm.
(5) Тъй като източникът на светлина съдържа ултравиолетови лъчи, кафява светло-екранираща плоча е поставена над предната част на сцената, за да се предотврати увреждането на ретината на ултравиолетовите лъчи.
(6) Нестабилността на напрежението ще намали експлоатационния живот на живачната лампа с високо налягане, а захранващият източник на светлина е оборудван със стабилизатор на напрежението.
(7) За да се удължи живота на живачната лампа, тя може да бъде изключена 15 минути след включването й; след като флуоресцентното захранване на живачната лампа бъде изключено, тя трябва да изчака поне 10 минути, за да рестартира живачните пари, за да се охладят и върнат в първоначалното си състояние, в противен случай животът на лампата ще бъде засегнат.
Наблюдение на образа чрез флуоресцентен микроскоп:
(1) Около 5-10 минути след включване на източника на флуоресцентна светлина, интензитетът на възбуждащата светлина има тенденция да бъде стабилен и пробата се зарежда за наблюдение; за да предотвратите потушаването на флуоресценцията на пробата, причинено от прекомерна възбуждаща светлина по време на процеса на фокусиране и търсене на обекти, първо намалете мащаба на флуоресцентния микроскоп. Регулирайте възбуждащата светлина до умерен интензитет с диафрагма с апертура или добавете ND филтър и премествайте редовно етапа за проби. След като потвърдите огледалния образ, регулирайте до флуоресцентно състояние за снимане и запис.
(2) Корекции за лошо качество на изображението. В допълнение към факторите за подготовка на пробата, необходимите корекции, които могат да бъдат направени, са:
① Изключете устройства за екраниране или ограничаване на светлината в оптичния път на изображението, като аксесоари за DIC, ND филтри и др.
②Регулирайте фокуса на приемника и размера на диафрагмата на апертурата на флуоресцентния микроскоп.
③ Регулирайте внимателно пръстена за коригиране на разликата в покритието на обектива на флуоресцентния микроскоп.
Точки на приложение на флуоресцентната микроскопия
Флуоресцентната микроскопия използва "актинична флуоресценция" изображения. Ако избраната дължина на вълната на възбуждане е в близката ултравиолетова област (320-400nm), която е невидима с невъоръжено око, емисионният спектър на флуоресценция също е по-къс от средната дължина на вълната на обикновени светлинни огледални източници на светлина. подобрявам. Високоенергийните фотони се сблъскват с електрони, карайки електроните да преминат от основно състояние към възбудено състояние. Електроните във възбудено състояние са много нестабилни и ще се върнат обратно в основното състояние. При този процес ще се изразходва част от топлинната енергия и ще се излъчват нови фотони. Новият фотон има по-ниска енергия от оригиналния фотон и следователно има по-голяма дължина на вълната. Тъй като новата дължина на вълната на фотона е различна от дължината на вълната на фотона на падащата светлина, двата светлинни лъча с различни дължини на вълната се разделят чрез определен метод на оптична обработка, така че ние виждаме само излъчените нови фотони (флуоресцентен сигнал), т.е. флуоресцентният микроскоп вижда флуоресцентни изображения.
