Как се наблюдава морфологията на микробните клетки под микроскоп?
Микроскопите са изобретени, за да виждат усмихнати обекти, които не могат да се видят с просто око. Микроорганизмите са много малки, така че трябва да бъдат увеличени и наблюдавани с помощта на микроскоп. Освен това има много видове микроорганизми, така че основно повечето оптични микроскопи могат да наблюдават микроорганизми. Следващият въпрос е какъв тип микроскоп трябва да се използва за наблюдение и анализ на какви микроорганизми. Обичайните микроскопи, които могат да се използват за наблюдение на микробната морфология, включват биологични микроскопи, фазово-контрастни микроскопи, обърнати микроскопи, флуоресцентни микроскопи, конфокални микроскопи и др.
По-долу са описани различните микроскопи, използвани за наблюдение на микроорганизми:
1. Обикновеният оптичен микроскоп използва естествена светлина или светлина като източник на светлина и неговата дължина на вълната е около 0.4 μm. Разделителната способност на микроскопа е половината от дължината на вълната, т.е. 0.2 μm, а най-малкото изображение, видимо с просто око, е 0.2 mm. Следователно използването на маслено (потопяемо) огледало за увеличение 1000 пъти може да увеличи частиците от 0,2 μm до 0,2 mm, видими с просто око. Обикновените оптични микроскопи могат да се използват за наблюдение на бактерии, актиномицети и гъбички.
2. Микроскопията в тъмно поле обикновено се използва за наблюдение на неоцветена микробна морфология и движение. След като кондензаторът на тъмното поле е инсталиран в обикновения микроскоп, светлината не може да проникне директно от средата и зрителното поле е тъмно. Когато пробата получи наклонена светлина от ръба на кондензатора, тя може да се разсее, така че ярки микроорганизми като бактерии или спирохети могат да се наблюдават на фона на тъмното поле.
3. Фазово контрастен микроскоп Фазово контрастният микроскоп използва светлинния ефект на плочата за фазова разлика, за да промени светлинната фаза и амплитудата на директната светлина и да преобразува разликата на светлинната фаза в разлика в интензитета на светлината. Под фазово-контрастен микроскоп, когато светлината преминава през неоцветен образец, разликата в светлинната фаза се причинява от несъответствието на плътността на различните части на образеца и могат да се наблюдават морфологията, вътрешната структура и начинът на движение на микроорганизмите.
4. Флуоресцентен микроскоп Флуоресцентният микроскоп е основно същият като обикновения оптичен микроскоп, основната разлика е източникът на светлина, филтърът и кондензаторът. В момента повечето от тях използват епи-светлинни устройства, а като източници на светлина обикновено се използват живачни лампи с високо налягане, които могат да излъчват ултравиолетова или синьо-виолетова светлина. Има два вида филтри: филтър за възбуждане и филтър за абсорбция. В допълнение към общите кондензатори със светло поле, кондензаторите с тъмно поле могат също да се използват във флуоресцентни микроскопи, използващи синя светлина за подобряване на контраста между флуоресценцията и фона. Този метод е приложим за откриване или идентифициране на бактерии, оцветени с флуоресцентни пигменти или комбинирани с флуоресцентни антитела.
5. Електронните микроскопи използват електронен поток като източник на светлина, а дължината на вълната е десетки хиляди пъти по-различна от видимата светлина, което значително подобрява разделителната способност. Той също така използва магнитна намотка като система за оптично усилване и увеличението може да достигне десетки хиляди или стотици хиляди пъти. Често се използва за наблюдение на вирусни частици и бактериална ултраструктура.
Наблюдение на неоцветени микробни проби:
Неоцветените проби обикновено могат да се използват за наблюдение на бактериалната морфология, мощност и движение. Бактериите са безцветни и прозрачни, когато не са оцветени и се наблюдават под микроскоп главно чрез разликата между индекса на пречупване на бактериите и околната среда. Бактериите с флагели се движат енергично, докато бактериите без флагели показват неправилно брауново движение. Жизнеспособни бактерии като Treponema pallidum, Leptospira и Campylobacter имат отличителни форми и модели на движение, които са от диагностично значение. Често използваните методи са метод на падане на налягането, метод на висящо падане и капилярен метод.
1. Нанесете вазелин около вдлъбнатия отвор на чистото вдлъбнато стъкло чрез метода на висяща капка, използвайте примка за инокулация, за да вземете пръстен от бактериална суспензия и го поставете в центъра на покривното стъкло, след което подравнете вдлъбнатия отвор на вдлъбнатото стъкло с капката в центъра на покривното стъкло и го покрийте, след това го обърнете бързо, натиснете леко покривното стъкло, за да залепне плътно за вазелина на ръба на вдлъбнатия отвор, и наблюдавайте под микроскоп с голямо увеличение (или тъмно поле).
2. Вземете пръстен от бактериална суспензия с примка за инокулиране и го поставете в центъра на чисто предметно стъкло чрез метода на падане на налягането и внимателно покрийте бактериалната суспензия с покривно стъкло, като внимавате да избегнете мехурчета и преливане на бактериалната суспензия . След като останете неподвижни за няколко секунди, наблюдавайте под мощен микроскоп в светло поле (или тъмно поле).
3. Капилярният метод се използва главно за изследване на кинетиката на анаеробни бактерии. Обикновено избирайте дължина 60~70mm. След като сифонирате суспензията от анаеробни бактерии през капиляр с отвор 0.5-1.0 mm, запечатайте двата края на капиляра с пламък. Капилярът се фиксира върху предметното стъкло с пластмасова хартия и се наблюдава под леща с висока мощност в тъмно поле.
Наблюдение на оцветени микробни проби с микроскоп:
След оцветяването на бактериалния образец, поради резкия контраст в цвета между бактериите и околната среда, морфологичните характеристики на бактериите (като размер, форма, разположение и т.н.) на бактериите и някои специални структури (като като капсули, флагели, спори и др.) могат да се наблюдават ясно под обикновен оптичен микроскоп и бактериите могат да бъдат класифицирани и идентифицирани според реактивността на оцветяване.
(1) Обща процедура на бактериално оцветяване Общата процедура на бактериално оцветяване е: намазка (изсушаване)—фиксация—оцветяване.
1. Приготвяне на намазка от кръв, секрети, екскрети, пункционна течност и течна култура и директни тънкослойни намазки върху предметни стъкла; аутопсия или заразени животински тъкани, намажете лезията с памучен тампон за вземане на проба. За приготвяне на бактериални колонии или тревни площи върху твърда среда, първо използвайте инокулационна примка, за да вземете пръстен с нормален физиологичен разтвор и да го поставите в центъра на предметното стъкло, след това използвайте стерилна инокулационна примка, за да вземете малко количество култура и да я смилате разпределете го равномерно в нормален физиологичен разтвор, разпределете го върху покрита повърхност от 1 cm2 и го оставете да изсъхне естествено при стайна температура или бавно да изсъхне на разстояние.
2. Целта на фиксацията е да убие бактериите, да коагулира бактериалния протеин и структура и да улесни оцветяването; насърчават бактериите да се придържат към предметното стъкло, за да се избегне отмиването им от вода по време на измиване; променят пропускливостта на бактериите към багрилата, което е от полза за оцветяването на вътреклетъчните структури на бактериите. Обикновено се фиксира чрез нагряване на пламък, като изсъхналото петно се прекарва бързо през пламъка 3 пъти. По-добре е да не изгаряте кожата на гърба на ръката, когато докоснете предметното стъкло.
3. Боядисване Според различните цели на инспекция, изберете различни методи за боядисване за боядисване. При боядисване добавете разтвора на багрилото на капки, за да увеличите покривността.
4. Морилка Всяко вещество, което може да засили афинитета между багрилото и боядисания обект, да фиксира багрилото върху боядисания обект и да причини промяна в пропускливостта на клетъчната мембрана, се нарича морилка. Обикновено се използват стипца, танинова киселина, метални соли и йод и др., а нагряването също се използва за насърчаване на оцветяването. Морилките могат да се използват между първичното оцветяване и контраоцветяването и могат да се използват и след фиксация или да се съдържат във фиксатора и оцветяването.
5. Обезцветяване Всеки химичен агент, който може да премахне цвета на боядисания предмет, се нарича обезцветител. Като обезцветители обикновено се използват етанол, ацетон и др. Обезцветяващият агент може да открие степента на стабилност на комбинацията от бактерии и багрила, която може да се използва за диференциално оцветяване.
6. Контраоцветяване Бактериите или техните структури, които са обезцветени, често се контраоцветяват с противооцветяващ разтвор за лесно наблюдение. Цветът на разтвора за контраоцветяване е различен от този на разтвора за първично боядисване, за да образува рязък контраст. Контраоцветяването не трябва да е много силно, за да не прикрие цвета на първоначалното оцветяване.
