Как можете да изберете правилния конфокален микроскоп за вас? Има ли някакъв специфичен метод?
Конфокалната микроскопия има повече предимства от микроскопията с широко поле. Конфокалната микроскопия може да прави непрекъснато оптично сечение на проби и да изключва смущения на сигнала от нефокални равнини. Поради тази причина приложението на конфокална микроскопия е наистина по-често срещано. На пазара обаче има все повече конфокални микроскопи. Как да изберем?
Конфокалната микроскопия има повече предимства от микроскопията с широко поле. Конфокалната микроскопия може да направи непрекъснати оптични разрези на проби и да изключи смущенията на сигнала от нефокалните равнини. Поради тази причина конфокалната микроскопия е наистина по-често срещана. На пазара обаче има все повече конфокални микроскопи. Как да изберем? Когато избирате конфокален микроскоп, има две основни и важни съображения: вида на пробата, която искате да изследвате (напр. фиксирани или живи клетки), и вида на анализа, който искате да извършите (напр. статични или динамични клетъчни процеси).
Конфокално изобразяване на фиксирани клетки
За изобразяване на фиксирани и оцветени клетки или тъкани обикновено избираме конфокално лазерно сканиране (LSCM). Това е главно защото фиксираните мъртви клетки нямат бързи биологични събития в живите клетки и могат да се възползват по-добре от по-високата пространствена разделителна способност на LSCM. LSCM изображенията са за оптично нарязване на пробата с лазер, а скоростта на сканиране (в зависимост от скоростта на огледалото на сканиращия масив) обикновено е 1 кадър в секунда. По-дългите времена на експозиция означават по-голям риск от фотоизбелване, но за фиксирани мъртви клетки времето не е критично и можем да го осредним, като направим няколко снимки.
Конфокално изобразяване на живи клетки
Изобразяването на живи клетки изисква допълнителна защита от неблагоприятна среда. Когато правим изображения, първото ни съображение е да поддържаме жизнеспособността и здравето на клетките. Нагревателните елементи с постоянна температура и системите за перфузия са от съществено значение, особено за изследвания с изтичане на времето. Бързите биохимични събития, които контролират физиологичното състояние на живите клетки, са това, което повечето хора искат да изучават, но тези събития са твърде бързи за конвенционалния LSCM. В допълнение, продължителното излагане на LSCM също предизвиква токсично светлинно увреждане на клетките. Следователно изобразяването на живи клетки изисква специални конфокални микроскопи.
Обикновено има две опции за конфокално изобразяване на живи клетки: бързо сканиращи лазерни сканиращи конфокални изображения и конфокални изображения с въртящ се диск. Бързо сканиращата конфокална микроскопия заменя по-бавните галванометрични огледала с по-бързи резонансни сканиращи огледала, позволяващи скорости на сканиране до 30fps; докато конфокалните въртящи се дискове (SDCM) имат предимството на по-бързо сканиране (макар и неизбежно със загуба на пространствена разделителна способност), неговата скорост може теоретично да достигне 2000 кадъра в секунда (на практика често е ограничена от други фактори).
Ако се притеснявате за фотоизбелване или много слаб флуоресцентен сигнал, тогава SDCM може да е по-подходящ. SDCM използва два въртящи се диска с подредени микроямки за разпръскване на възбуждащата светлина. За разлика от LSCM, който сканира пробното петно, SDCM придобива множество петна наведнъж (около 100 пикселни петна), така че скоростта се увеличава значително и фотоизбелването на SDCM и по-малко фототоксичност. Въпреки това можете също да използвате бързо сканиращи конфокали, за да увеличите скоростта на сканиране, комбинирани с високочувствителни детектори и да намалите енергията на възбуждащата светлина, за да намалите фототоксичността, което може да поддържа богатите функции на традиционните конфокали.
Автоматизирана конфокална система за изображения
Някои изследователи обичат да намират начини да модифицират микроскопа така, че да отговаря на техните индивидуални нужди. А някои изследователи дори не се интересуват как всъщност работят микроскопите. За последните автоматизираният конфокален микроскоп може да им хареса повече. Например Olympus FluoViewFV10i е такъв напълно автоматичен настолен 4-лазерен конфокален микроскоп. Неговата компактна интегрирана структура не изисква почти никакво място за монтаж. Този тип инструменти са идеални за изследователи, които трябва да събират много данни за изображения всеки ден, но разбира се, те не отразяват напълно функционалността и гъвкавостта на традиционните конфокални изображения. Освен това NikonA1 е и напълно автоматична конфокална система. Подобно на повечето конвенционални конфокални сканиращи микроскопи, NikonA1 използва сканираща глава с галванометър, която има по-висока разделителна способност от A1R с хибридна сканираща глава, но малко по-бавна скорост (A1R ~30fps)
