Флуоресцентно наблюдение на оптичен микроскоп
Флуоресценцията се отнася до процеса, при който флуоресцентно вещество излъчва светлина с по-голяма дължина на вълната почти едновременно, когато се облъчва със светлина с определена дължина на вълната (Фигура 1). Когато светлина с определена дължина на вълната (дължина на вълната на възбуждане) удари молекула, като тези във флуорофора, фотонната енергия се абсорбира от електроните на молекулата. След това електроните преминават от основно състояние (S0) към по-високо енергийно ниво, възбуденото състояние (S1'). Този процес се нарича възбуждане①. Електронът остава във възбудено състояние за 10-9–10-8 секунди, по време на които електронът губи част от енергия②. По време на процеса на напускане на електрони от възбудено състояние (S1) и връщане в основно състояние③, останалата енергия, погълната по време на процеса на възбуждане, се освобождава.
Флуоресцентна диаграма на Яблонски
Времето на престой на флуоресцентната молекула във възбудено състояние е продължителността на живота на флуоресценцията, която обикновено е на ниво наносекунди и е присъща характеристика на самата флуоресцентна молекула. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), който използва технология за изобразяване на флуоресценция през целия живот, може да извърши по-задълбочени функционални измервания в допълнение към изобразяването на интензитета на флуоресценцията и да получи молекулна конформация, междумолекулни взаимодействия и микросредата на молекулите и т.н. Информация, която е трудна за получавате с конвенционално оптично изображение.
Друго важно свойство на флуоресценцията е отместването на Стокс, разликата в дължината на вълната между пиковете на възбуждане и излъчване (Фигура 2). Обикновено дължината на вълната на излъчване е по-дълга от дължината на вълната на възбуждане. Това е така, защото електроните ще загубят част от енергията си чрез процеса на релаксация, след като флуоресцентното вещество е възбудено и преди да освободят фотони. Флуоресцентните вещества с по-големи Стоксови измествания се наблюдават по-лесно под флуоресцентен микроскоп.
флуоресцентен микроскоп
Флуоресцентният микроскоп е оптичен микроскоп, който използва флуоресцентни свойства за наблюдение и изобразяване и се използва широко в различни области като клетъчна биология, невробиология, ботаника, микробиология, патология и генетика. Флуоресцентното изобразяване има предимствата на висока чувствителност и висока специфичност и е много подходящо за наблюдение на разпределението на специфични протеини и органели в тъкани и клетки, изследване на колокализация и взаимодействие, проследяване на динамични процеси в живота, като промени в концентрацията на йони и т.н.
Повечето молекули в клетките не флуоресцират и ако искате да ги видите, ги етикетирате флуоресцентно. Има много методи за флуоресцентно маркиране, като директно маркиране (като използване на DAPI за маркиране на ДНК) или имунооцветяване с помощта на антиген-свързващите свойства на антителата, или използване на флуоресцентни протеини (като GFP, зелен флуоресцентен протеин) за маркиране на целеви протеини , и обратимо свързване. синтетични багрила (като Fura-2) и др.
Обърнат флуоресцентен микроскоп MF53-N
Понастоящем флуоресцентният микроскоп се е превърнал в стандартно оборудване за изображения на различни лаборатории и платформи за изображения и е добър помощник за нашите ежедневни експерименти. Флуоресцентните микроскопи се разделят главно на три категории: изправени флуоресцентни микроскопи (подходящи за срезове), обърнати флуоресцентни микроскопи (подходящи за живи клетки, като се вземе предвид срезовете), флуоресцентни стереоскопи (подходящи за по-големи екземпляри, като растения, риба зебра (възрастни/ембриони) ), медака, органи на мишка/плъх и др.).
Технологията за изображения с флуоресцентна микроскопия е широко използвана и богата на видове, а нови технологии все още се появяват. Можете да изберете технологията, за да завършите собственото си проучване.
