Характеристики и приложения на конфокалната лазерна микроскопия
Лазерно сканиращият конфокален микроскоп (LSCM) е вид микроскоп, проектиран на базата на технология за конюгирано фокусиране, т.е. да направи източника на лазерна светлина, изпитваната проба и детектора в конюгатна позиция един спрямо друг.
Фундаментален
В общите микроскопи фокалната равнина на лещата на обектива съвпада с детектора, така че наблюдаваната равнина на изображението е изолирана от съседната аксиална равнина, докато в конфокалните микроскопи пробата се осветява чрез използване на ограничено от дифракция светлинно петно, а в Този ефект на изолация се постига чрез използване на дупка в пътя на събирателната светлина във фокусната точка на спот конюгата за филтриране на разсеяна светлина за подобряване на разделителната способност.
Функции за изображения
Само светлината, отразена обратно от конюгирания слой на пробата, може да премине през малкия отвор в пътя на събирателната светлина, а останалите неуместни отражения на слоя на пробата се блокират от малкия отвор. Това може да доведе до значително увеличение на разделителната способност. По-долу е показано едно до друго сравнение на многомерна флуоресцентна микроскопия и конфокална микроскопия на една и съща дебела проба. Когато се заснемат поредица от изображения в различни фокални равнини, може да се генерира това, което обикновено се нарича "z-стек", и това изображение показва както разделителната способност, така и контраста, предлагани от конфокалната микроскопия, и основните причини за тези печалби. Изследването на изображението в горната част на стека с равнината на изображение над тъканта разкрива много разсеяна светлина във флуоресцентното изображение, докато конфокалното изображение изглежда черно. Това намаление на PSF в аксиална посока е пряко отговорно за разликата в разделителната способност, наблюдавана при оптичния интерфейс в средата на z-стека.
Друга характеристика на лазерната сканираща конфокална микроскопия е, че това е технология за сканиране на изображения. Традиционната технология за осветяване с широко поле осветява цялата проба, така че изображението може да бъде директно уловено с невъоръжено око или детектор, но LSCM използва лъч или Множество фокусирани лъчи преминават през пробата за сканиране и изобразяване и полученото изображение е наречена оптична секция. По-долу е показана разликата между традиционния метод на осветяване с широко поле и метода на лазерно сканиращо конфокално осветяване.
Ето защо практически метод на работа на модерен конфокален микроскоп е показан на фигурата по-долу. Възбуждащата светлина, излъчвана от лазера, преминава през дихроично огледало и сканира в посоките x и y на пробата през двойка вибриращи огледала. Възбуждането (или отражението) на пробата Светлината влиза в PMT детектора през отвора и се записва, а записаното сканирано изображение се реконструира от компютъра, за да се получи действителното изображение на пробата.
