Определяне на броя на микроорганизмите - методът на директното броене на микроскопа!
Растежът на бактериалната популация се проявява чрез увеличаване на броя на клетките или увеличаване на клетъчната маса. Методите за определяне на броя на клетките включват метод за директно преброяване с микроскоп, метод за преброяване на колонии в плочи, метод на съотношение на фотоелектрическо масло, метод на максимална вероятност и метод на мембранна филтрация. Методите за измерване на клетъчната материя включват определяне на сухото тегло на клетката, определяне на определени клетъчни компоненти като съдържание на азот, РНК и ДНК и определяне на метаболити. Накратко, има много методи за измерване на растежа на микроорганизми, всеки със своите предимства и недостатъци и трябва да се избира според конкретната ситуация. Този експеримент представя главно метода на директно броене с микроскоп, който обикновено се използва в производството и научните изследвания.
1. Изисквания за целта
1. Изяснете принципа на броенето на кръвните клетки.
2. Овладейте метода за преброяване на микроорганизми с помощта на брояч на кръвни клетки.
2. Основни принципи
Методът за директно преброяване с микроскоп е прост, бърз и интуитивен метод за директно преброяване на малко количество суспензия от пробата за тестване върху специално предметно стъкло с определена площ и обем (известен също като брояч на бактерии). Методи. Понастоящем често използваните броячи на бактерии в страната и чужбина са: табло за броене на кръвни клетки, брояч на бактерии Peteroff-Hauser и брояч на бактерии Hawksley и др. Те могат да се използват за преброяване на дрожди, бактерии, спори на плесени и други суспензии, и основният принцип е същият. Последните два типа броячи на бактерии имат общ обем от 0.02 mm3, след като са покрити с покривно стъкло, а разстоянието между покривното стъкло и предметното стъкло е само 0,02 mm, така че маслото потопяемият обектив може да се използва за наблюдение и наблюдение на малки клетки като бактерии. броя. В допълнение към тези бактериометри съществува и метод за оценка на съотношението на площта на цитонамазката към площта на зрителното поле, наблюдавана директно под микроскоп, който обикновено се използва за бактериологично изследване на мляко. Предимствата на метода на директно броене с микроскоп са интуитивен, бърз и лесен за работа. Недостатъкът на този метод обаче е, че измереният резултат обикновено е сбор от мъртви и живи клетки. Понастоящем има някои методи за преодоляване на този недостатък, като комбинация от микрокамерна култура, оцветяваща жизнеспособни бактерии (кратко време) и добавяне на инхибитори на клетъчното делене, за да се постигне целта за преброяване само на жизнеспособни бактерии.
В този експеримент е използван хемоцитометър като пример за директно микроскопско броене. За използването на другите два вида броячи на бактерии, моля, вижте инструкциите на всеки производител. Преброяването директно под микроскоп с хемоцитометър е често използван метод за преброяване на микроорганизми. Броещата плоча е специално стъкло, върху което три платформи са оформени от четири слота; по-широката платформа в средата е разделена на две половини от къс напречен прорез и има решетка от всяка страна на платформата. Всяка мрежа е разделена на девет големи квадрата, а големият квадрат в средата е стаята за броене. Структурата на плочата за броене на кръвни клетки е показана на фигура l{{{{10}}}}. Скалата на помещението за преброяване обикновено има две спецификации, едната е голям квадрат, разделен на 25 средни квадрата, а всеки среден квадрат е разделен на 16 малки квадрата (Фигура 15-2); другият е голям квадрат. Квадратът е разделен на 16 средни квадрата, а всеки среден квадрат е разделен на 25 малки квадрата, но без значение какъв вид е дъската за броене, във всеки голям квадрат има 400 малки квадрата. Дължината на страната на всеки голям квадрат е 1 mm, а площта на всеки голям квадрат е 1 mm2. След покриване с покривно стъкло, височината между покривното стъкло и предметното стъкло е 0,1 mm, така че обемът на камерата за броене е 0,lmm3 (една хилядна от милилитъра). Фигура 15-1 Структурата на таблото за броене на кръвни клетки (1) Фигура 15-2 Структурата на таблото за броене на кръвни клетки (2) A. Изглед отпред; B. Надлъжен разрез; Уголемената решетка, големият квадрат в средата е камерата за броене 1. Кръвни клетки Плака за броене; 2. Покривно стъкло; 3. Когато броите в камерата за броене, обикновено пребройте общия брой бактерии в пет квадрата, след това изчислете средната стойност на всеки квадрат и умножете по 25 или 16, за да получите Общият брой бактерии в голям квадрат след това се преобразува в общ брой бактерии в 1 ml бактериален разтвор. Нека общият брой бактерии в петте квадрата е A, а съотношението на разреждане на бактериалния разтвор да бъде B. Ако това е плоча за броене с 25 квадрата, общият брой бактерии в 1 ml бактериален разтвор {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(парчета) По същия начин, ако това е плоча за броене с 16 средни квадрата, общият брой бактерии в 1mL бактериален разтвор=A/ 5×16×104×B=32000A·B (части)
3. Оборудване
1. Бактерии
Saccharomyces cerevisiae
2. Инструменти или други прибори
Хемоцитометър, микроскоп, покривно стъкло, стерилен капкомер.
4. Стъпки на операцията
1. Приготвяне на бактериална суспензия
Saccharomyces cerevisiae се приготвя в бактериална суспензия с подходяща концентрация със стерилен физиологичен разтвор.
2. Броене на микроскоп
Преди да добавите проби, проверете под микроскоп камерата за броене на плаката за броене. Ако има мръсотия, тя трябва да бъде почистена и изсушена преди броене.
3. Добавете проба
Покрийте чистия и сух хемоцитометър с покривно стъкло и след това използвайте стерилен капкомер, за да капнете малка капка от разклатената суспензия на Saccharomyces cerevisiae от ръба на покривното стъкло и оставете бактериалния разтвор автоматично да се движи през празнината чрез капилярна осмоза. Влизайки в стаята за броене, общата стая за броене може да се напълни с бактериална течност. При вземане на проби първо разклатете бактериалния разтвор; при добавяне на проби не трябва да се генерират въздушни мехурчета в камерата за броене.
4. Микроскопско броене
След като добавите пробата, постойте неподвижно за 5 минути, след това поставете хемоцитометъра на стола на микроскопа, първо намерете местоположението на камерата за броене с микроскоп с ниска мощност и след това превключете на микроскоп с висока мощност за броене. Регулирайте интензитета на светлината на микроскопа по подходящ начин. За микроскопи, които използват огледала за осветяване, внимавайте да не се отклонявате от едната страна на светлината, в противен случай няма да е лесно да видите квадратните линии на помещението за броене ясно в зрителното поле или ще се виждат само вертикални линии или хоризонтални линии да се види. Ако се установи, че бактериалният разтвор е твърде концентриран или твърде разреден преди преброяване, е необходимо да се коригира разреждането преди преброяване. Обикновено разреждането на пробата изисква около 5 до 10 бактерии във всяка малка клетка. Всяка камера за броене избира 5 средни клетки (по избор 4 ъгъла и една средна клетка в центъра) за броене. Клетките, разположени на линията на мрежата, обикновено се броят само на горната и дясна линия. В случай на пъпкуване на дрожди, когато размерът на пъпката достигне половината от майчината клетка, тя се брои като две бактериални клетки. За да преброите проба, изчислете бактериалното съдържание на пробата, като изчислите средната стойност от двете камери за преброяване.
5. Измийте броя на кръвните клетки
След употреба изплакнете таблото за броене на кръвни клетки с вода от чешмата, не търкайте с твърди предмети и го изсушете сами или със сешоар след измиване. Микроскопско изследване, за да се види дали има остатъчни бактерии или други утайки във всяка малка клетка. Ако не е чист, трябва да се мие многократно, докато стане чист.
