Приложение на флуоресцентна флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение
TIRFM (флуоресцентен микроскоп с пълно вътрешно отражение), флуоресцентен микроскоп с пълно вътрешно отражение, когато светлината навлезе в среда с по-нисък индекс на пречупване от среда с висок индекс на пречупване, ако ъгълът на падане е достатъчно голям, цялата светлина се отразява без пречупване, но в интерфейса на двете среди произвежда мимолетни вълни, които могат да възбудят флуоресценцията в рамките на 100 nm близо до интерфейса, за да реализират наблюдението на повърхността на обекта. Възбуждащата светлина може да бъде изпратена през осветителя на конвенционален флуоресцентен микроскоп или специален осветител и ъгълът на падане на лазера може да се контролира. Методът на моментално възбуждане на полето се използва, за да се предотврати навлизането на възбуждащата светлина в детектора. Възбуждащата светлина на границата между стъкло и вода създава пълна вътрешна, реализирана чрез отражение. Поради експоненциалното затихване на възбуждащата светлина, само зоната на пробата, много близо до общата отражателна повърхност, ще произведе флуоресцентно отражение, което значително намалява интерференцията на фоновия светлинен шум към целта за наблюдение, така че тази технология се използва широко в динамичното наблюдение на вещества от клетъчната повърхност.
Схематична диаграма на флуоресцентна микроскопия с пълно вътрешно отражение (TIRFM)
①Проба ②Еванесцентен вълнов диапазон ③Покривно стъкло ④Потапяне в масло ⑤Мишена ⑥Емисионен лъч (сигнал) ⑦Възбуждащ лъч
За да се постигне пълно вътрешно отражение, е необходим голям ъгъл на падане, например ъгълът на падане при границата стъкло-вода е по-голям от 61 градуса. Това може да се постигне чрез призма, наречена базирана на призма TIRFM, или чрез обективна леща с висока цифрова апертура, която се нарича TIRFM тип обектив. Настоящите комерсиализирани флуоресцентни микроскопи с пълно вътрешно отражение обикновено са от типа обективна леща, с висока скорост и висока точност.
Флуоресцентната микроскопия с пълно вътрешно отражение се използва широко в някои биологични области, тъй като може да реализира наблюдение на флуоресценция в много тънък диапазон (по-малко от 100 nm) върху повърхността на обекти. Като например следните приложения:
Наблюдение на изображения на клетъчната повърхност: повърхностна структура на клетъчната мембрана, контакт на клетъчната повърхност, динамика на мембранната повърхност/локализация на протеина.
Наблюдение и манипулиране на една молекула: миозин, актин и Cy3-белязан АТФ.
Движение на повърхността на клетъчната мембрана: като поглъщане на везикули, издишване на везикули и екзокринни везикули. на
Наблюдение на феномена на образуване на калциеви искри в клетъчната мембрана, мониторинг на йонни канали.
Молекулярни двигателни изследвания: ротационни двигатели, цитоскелетни протеини, полимери, G протеини, пръстенови протеини, нуклеотидни двигатели.
В допълнение към областта на биологията, той също има добри приложения в областта на химията за наблюдение на химически молекулярни структури.
